人脐血干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的实验研究

【摘要】  目的 利用人脐带血干细胞移植治疗大鼠心肌梗死,探索治疗心肌梗死的新方法。方法 将清洁级Wistar大鼠50只,随机分为3组:A组(心梗对照组)10只;B组(脐带血注射组)20只;C组(人脐带血干细胞移植组)20只。成功建立心肌梗死模型30 min后,C组于缺血区心肌组织注射人脐带血干细胞50 μl,B组注射脐带血50 μl.4周后行心功能和病理学检测,并进行比较。结果 C组大鼠的左室前壁厚度、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室短轴缩短率及左室射血分数较A组和B组有明显改善,各组间差异均有统计学意义(P<0.05);其毛细血管密度明显增加。结论 人脐带血干细胞移植治疗可改善心肌梗死大鼠的心功能。

【关键词】  人脐带血干细胞;移植;心肌梗死

Transplantation of human umbilical cord blood stem cells in treatment of experimental acute myocardial ischemia in rats

　　XIE Qiang,JIANG Hongwei,BAI Xuetao,CAO Xu,LI Meng,JING Ming

　　(Department of Cardiovascular Surgery,Fourth Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110032,China)

　　【Abstract】 Objective To investigate a novel method to cure acute myocardial ischemia(AMI)by human umbilical cord blood stem cells(HUCBSC)transplantation.Methods A total of 50 Wistar rats were randomly divided as three groups.At 30 min after establishment of AMI,HUCBSC was transplanted into the ischemic myocardium in HUCBSC transplantation group(n=20),while the same volume of cord blood was transplanted into the ischemic myocardium in cord blood injection group(n=20).Myocardial ischemia control group(n=10)only received left coronary artery ligation.Four weeks later,the examinations of cardiac function and pathology were conducted and the results were compared between three groups.Results The thickness of anterior left ventricular wall(LVAW),left ventricular internal diameter at end  diastole(LVDd),left ventricular internal diameter at end  systole(LVDs),left ventricular fractional shortening(FS)and left ventricular ejection fractions(EF)in HUCBSC group improved significantly than those in other two groups(P<0.05).In addition,capillary density in HUCBSC group increased evidently.Conclusion Transplantation of HUCBSC can improve myocardial function.

　　【Key words】 human umbilical cord blood stem cells;transplantation;myocardial ischemia

　　随着分子生物学和细胞生物学工程技术的发展以及对干细胞研究的深入,人们通过移植技术将具有分化潜力的干细胞移植到坏死的心肌处,以期达到实现心肌再生、改善心功能的目的,干细胞移植已经成为治疗心脏疾病的最新方法。目前干细胞的获得途径主要有胚胎、骨髓和脐血。近年来,许多学者用人的脐血干细胞(human umbilical cord blood stem cells,HUCBSC)进行了心肌移植的动物实验,结果显示移植的干细胞不仅起到心肌再生、稳定心肌组织结构的作用,还可通过细胞因子分泌,促进梗死心肌的血管再生,改善心功能,减轻氧自由基对心肌的损伤,缩小心肌梗死面积[12]。本研究通过观察人脐血干细胞移植在治疗大鼠心肌梗死中的作用,为进一步临床应用干细胞移植提供新的证据。

　　1 材料与方法

　　1.1 脐带血采集和 HUCBSC分离培养

　　选择2009年3月于我院妇产科分娩的无妊娠并发症的足月分娩产妇1例。 在无菌条件下,待胎儿娩出而胎盘仍在宫腔内时,在距胎儿5～7 cm 处结扎并剪断脐带,用加有 20 U /ml肝素的注射器穿刺脐静脉,抽取脐带血50 ml.采用 FicollHypague法[3]分离 HUCBSC,将脐带血用 PBS以1∶1稀释后轻轻加入盛有 Ficoll分离液的离心管中,2 500 r/min离心25 min,吸管吸取分层界面的白色环形絮状物(富含单个核细胞)。 PBS洗涤2次(1 200 r/min,离心 8 min)除去 Ficoll分离液,沉积细胞用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养基培养,调整细胞密度为 1×108 个 /ml,接种于25 cm2 的培养瓶内,放置在37 ℃、5%CO2 、饱和湿度的培养箱中培养。细胞接种12 h后即可见极少量的梭形细胞贴壁,孵育24 h后更换培养基,24 h后贴壁细胞开始增多,似成纤维细胞,夹杂少许红细胞及细胞碎片。 去除红细胞及其他未贴壁细胞,以后视细胞生长情况平均3 d换液1次。随着细胞换液,未贴壁细胞逐渐清除,贴壁细胞的同质性增强,约3周后细胞融合达瓶底生长面积的70%～80%,即可进行细胞移植。

　　1.2 实验动物及主要试剂

　　选用Wistar雄性大鼠(中国医科大学实验动物中心提供),体重250～300 g.DMEM高糖培养基购自美国 Gibco公司;胎牛血清、Ficoll分离液购自美国 Sigma公司;青霉素、链霉素、PBS购自上海碧云天生物技术有限公司。

　　1.3 动物模型的构建

　　动物取仰卧位,腹腔内注射戊巴比妥液(40 mg/kg),麻醉下行气管插管,应用小动物用呼吸机辅助呼吸。经左侧第4肋间开胸,扩开肋间,剪开心包,暴露心脏。于左心耳下,用60外科针带线结扎左冠状动脉前降支起始部,以远端供血区心肌颜色发绀、苍白为模型制作成功的标志。50只大鼠随机分为3组:心梗对照组(10只),仅行左冠状动脉起始部结扎;脐带血注射组(20只),将50 μl脐带血分6点注入到梗死区边缘的心肌组织内;干细胞移植组(20只),将50 μl HUCBSC分6点注入到梗死区边缘的心肌组织内。关闭胸腔,继续饲养。围术期应用青霉素200 000 U/kg预防感染,连用3 d.于手术后饲养4周,快速推注10%氯化钾注射液处死动物,取心肌标本常规制作石蜡切片。

　　1.4 心功能检测

　　分别于术前、术后4周在无麻醉的清醒状态下检测心功能。重点测量左室前壁厚度、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室短轴缩短率及左室射血分数等各项指标。

　　1.5 梗死心肌的病理形态学观察

　　术后4周,处死各组大鼠,使心脏停搏于舒张期。 取出心脏,剪除双侧心房及右心室,沿左心室长轴由心尖到底部做3 mm厚切片,镜下初步观察心肌梗死区域病理组织学表现。选择心肌梗死表现最明显的蜡块切片,行酸性复红染色,用Leica Q Win 多媒体彩色病理图文分析软件进行图像分析,自动测量出切片中心肌梗死组织占总面积的百分比。

　　1.6 碱性磷酸酶组织染色测定毛细血管密度

　　毛细血管富含碱性磷酸酶(AKP),AKP在碱性缓冲液中催化底物α磷酸萘酯水解,生成α萘酚,后者进而与一种稳定的重氮盐偶联,生成不溶性偶氮染料沉着于有AKP活性的部位[4]。左室心尖部心肌组织切片AKP染色后毛细血管呈紫兰色,在组织片的左上方、左下方、中间、右上方和右下方各选取毛细血管染色最多的一个视野(×10)计数,以每个视野的毛细血管数除以观察面积中该视野的毛细血管密度,再以5个视野毛细血管密度的平均值作为该组织片的毛细血管密度。

　　1.7 统计学分析

　　所有计量资料用均数±标准差表示;运用 SPSS 13.0统计软件进行分析;组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 3组大鼠术后心功能检查情况

　　HUCBSC移植后大鼠心功能明显改善,与心梗对照组和脐带血注射组相比,LVAWs、LVDd、LVDs、FS%及EF%间差异均有统计学意义(P<0.05);而脐带血注射组与心梗对照组相比无统计学差异(P>0.05)(表1)。表1 术后4周3组超声心动图指标比较

　　Table 1 Results of cardiac function 4 weeks after operation

　　GroupLVAWsLVDdLVDsFS(%)EF(%)A0.26±0.010.75±0.040.61±0.0430.94±1.2042.82±2.50B0.26±0.820.74±0.020.60±0.0431.64±1.5543.66±1.50C0.27±0.01ab0.48±0.03ab0.29±0.02ab43.32±1.60ab69.84±1.70ab

　　a:P<0.05,vs group A;b:P<0.05,vs group B

　　2.2 干细胞移植后梗死面积和毛细血管的变化

　　大体病理标本可见,HUCBSC移植组较心梗对照组梗死面积明显减少,左心室结构重塑轻。组织学测量分析结果亦表明,左心室梗死面积HUCBSC移植组(28.66±1.50)明显少于心梗对照组(45.58±2.60)和脐带血注射组(44.3±1.42)(P<0.05),见图1、2;干细胞移植组毛细血管密度(6.10±0.23)在梗死边缘区和中心区均明显高于心梗对照组(4.05±0.37)和脐带血注射组(4.12士0.27)(P<0.05),见图3.

　　3 讨论

　　骨髓干细胞能在特定的环境下再生为心肌细胞,改善心功能。大量的基础和临床研究证实了骨髓来源干细胞能够改善AMI 患者的预后[59],使干细胞移植这一治疗方法备受关注。但是,骨髓干细胞取材具有有创性、分离和取材受时间限制、细胞数量不足、干细胞分化能力低、影响因素多等缺点,限制了其应用。脐血干细胞则具有取材方便、干细胞数量多、干细胞分化能力强、影响因素少、不受时间限制等特点,从而引起关注。

　　国内外有很多学者对脐血干细胞的作用进行了研究,但都集中在动物实验上,尚无临床研究。动物实验结果显示移植的脐血干细胞和骨髓干细胞具有同样的功能,不仅起到心肌再生,稳定心肌组织结构的作用,还可通过细胞因子分泌,促进梗死心肌的血管再生,改善心功能,减轻氧自由基对心肌的损伤,缩小心肌梗死面积[1012]。本实验中,在大鼠心肌梗死模型基础上建立了异种脐血干细胞移植模型。这是一个类似临床的实验模型,因为供体细胞可以提前筛选和准备,以便在病人需要时可以立即使用。我们在心肌梗死急性期,成功地进行了心肌内注射移植脐血干细胞,移植细胞能成功地植入并存活4周,这一方法是安全可靠的,未见明显的超急性期和急性期移植排斥反应。本实验将异种脐血干细胞移植到大鼠心肌梗死区,术后4周时脐血干细胞组较急性心肌梗死组左室射血分数明显升高,梗死面积明显缩小,心肌梗死边缘区和中心区毛细血管数目显著增多,并可见不成熟的心肌样细胞。我们在实验中观察到,脐血干细胞移植可以显著改善心肌梗死后大鼠的一般状况,这种作用最早可以出现在脐血干细胞移植后的2～3 d内。目前研究认为,HUCBSC可以分泌一系列生长因子和细胞因子,包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胎盘生长因子、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α和肝细胞生长因子、胰岛素样生长激素1等[1314]。然而,绝大多数研究者们主要集中于研究这种旁分泌功能对局部的作用上,探讨这些因子与血管新生、细胞凋亡、心室重构等的关系,或者不断寻找与这些病理过程相关的因子[15]。我们推测,仅仅是局部的血管新生和细胞凋亡的减少,对于缩小梗死面积、提高心功能是可以解释的,而对于整体机能的改善可能还有另外的机制,更多的因子有待发现。

　　本研究显示,HUCBSC心肌内注射移植治疗可改善心肌梗死大鼠的心功能,而且在不使用免疫抑制剂的情况下未见明显不良反应,为心肌梗死的治疗研究提供了一种有效的途径。但是本研究仅为动物实验,周期短,样本量小,对于远期治疗效果难以做出明确的评价,离临床应用还有差距,有待于进一步的研究和完善。

【参考文献】
  　　[1] Henning RJ,Burgos JD,Vasko M,et al.Human cord blood cells and myocardial infarction:effect of dose and route of administration on infarct size[J].Cell Transplant,2007,16(9):907917.

　　[2] 方志成,王玮,王卫民,等.脐血间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞超微结构特征[J].研究实用医学杂志,2005,21(17):18631865.

　　[3] 汤天军,杨波.人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究[J].实用医学杂志,2005,21(21):24122414.

　　[4] 丁东,曹克将,金艳,等.骨髓间充质干细胞移植对梗死心脏血流动力学及心肌重塑的影响[J].中国微循环,2007,11(2):8083.

　　[5] Klein HM,Ghodsizad A,Marktanner R,et al.Intramyocardial implantation of CD133+ stem cells improved cardiac function without bypass surgery[J].Heart Surg Forum,2007,10(1):E6669.

　　[6] Lunde K,Solheim S,Aakhus S,et al.Exercise capacity and quality of life after intracoronary injection of autologous mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction:results from the Autologous Stem cell Transplantation in Acute Myocardial Infarction(ASTAMI)randomized controlled trial[J].Am Heart J,2007,154(4):710718.

　　[7] Schchinger V,Erbs S,Elssser A,et al.Improved clinical outcome after intracoronary administration of bonemarrowderived progenitor cells in acute myocardial infarction:final 1year results of the REPAIRAMI trial[J].Eur Heart J,2006,27(23):27752783.

　　[8] Wollert KC,Meyer GP,Lotz J,et al.Intracoronary autologous bone marrow cell transfer after myocardial infarction:the BOOST randomized controlled clinical trial[J].Lancet,2004,364:141148.

　　[9] Meyer GP,Wollert KC,Lotz J,et al.Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction:eighteen months’ follow up data from the randomized,controlled BOOST(bone marrow transfer to enhance ST elevation infarct regeneration)trial[J].Circulation,2006,113:12871294.

　　[10] Guolong Yu,Cesar V Borlongan,Christine E Stahl,et al.Transplantation of human umbilical cord blood cells for the repair of myocardial infarction[J].Med Sci Monit,2008,14(10):RA163172.

　　[11] Hirata Y,Sata M,Motomura N,et al.Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,327(2):609614.

　　[12] Leor J,Guetta E,Feinberg MS,et al.Human umbilical cord bloodderived CD 133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium[J].Stem Cells,2006,24(3):772780.

　　[13] Hu CH,Wu GF,Wang XQ,et al.Transplanted human umbilical cord blood mononuclear cells improve left ventricular function through angiogenesis in myocardial infarction[J].Chin Med J(Engl),2006,119:14991506.

　　[14] Henning RJ,Burgos JD,Ondrovic L,et al.Human umbilical cord blood progenitor cells are attracted to infarcted myocardium and signifi cantly reduce myocardial infarction size[J].Cell Transplant,2006,15:647658.

　　[15] Sung AC,Eun JL,HyunJK,et al.Impact of myocardial infarct proteins and oscillating pressure on the differentiation of mesenchymal stem cells:effect of acute myocardial infarction on stem cell differentiation[J].Stem Cells,2008,26:19011912.