慢性ITP患者外周血T细胞亚型的分析

【摘要】  目的 探讨慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)患者外周血Th1/ Th2、Tc1/ Tc2的平衡状态。方法 收集CITP患者外周抗凝静脉血,分离纯化得T细胞,用抗IFNγ及IL4 单抗结合患者外周血T细胞,流式细胞术分析Th1、Th2、Tc1、Tc2 细胞数以及Th1/ Th2、Tc1/ Tc2比值。结果 CITP患者与健康对照组比较,外周血CD3+细胞和CD8+细胞明显增加(分别为P<0.01和P<0.05),CD4+/CD8+比例倒置(P<0.05);Th1细胞数显著升高(P<0.05),Th2细胞下降明显(P<0.05),Th1/ Th2 比值上升(P<0.05)。Tc1和Tc2较正常对照无明显变化(P>0.05),但Tc1/ Tc2显著增加(P<0.05)。结论 CITP患者外周血细胞免疫功能低下,Th1 及Tc1/ Tc2 细胞比例升高,呈Th1类细胞优势。

【关键词】  慢性特发性血小板减少性紫癜;Th1/Th2;Tc1/Tc2

　【Abstract】 Objective To investigate the change of Th1/Th2 and Tc1/ Tc2 cells balance in patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (CITP). Methods The ratios of Th1/Th2 and Tc1/Tc2 in peripheral blood T cells were analyzed by flowcytometry (FCM) in vitro. Results Compared with healthy control group,CD3+ and CD8+ cells increased significantly in the patients of CITP group (P<0.01 and P<0.05,respectively),but CD4/ CD8 ratio was reversed. Furthermore,an obviously increased Th1 cells and decreased Th2 cells were observed(P<0.05),hence a increased Th1/Th2 ratio was found (P<0.05). The average percentages of Tc1 and Tc2 did not change (P>0.05),while Tc1/Tc2 ratio obviously increased (P<0.05). Conclusion The immune function of patients with CITP decreases. The ratios of Th1/ Th2 and Tc1/ Tc2 in peripheral blood T cells increase obviously in CITP patients,which suggests that CITP is a Th1 dominated disease.

　　【Key words】 Idiopathic thrombocytopenic purpura; Th1/Th2; Tc1/Tc2

　　成人慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)是一种慢性获得性自身免疫性疾病。其发病机制尚未完全阐明,近几年发现CITP的发生发展与患者体内Th1类/Th2类细胞的平衡失调有关[1]。本实验应用流式细胞仪检测CITP患者外周血T细胞CD4、CD8亚型,以及细胞因子IFNγ和IL4的表达情况,分析患者外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2的平衡状态,以探讨CITP发生的细胞免疫机制。

　　1 病例和方法

　　本组CITP患者26例,诊断均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》,年龄在15～47岁,中位年龄25岁,男9例,女17例;选择同年龄段、性别相近的健康人20名,所选患者及健康人均排除引起继发性血小板减少、Th细胞亚群及Tc细胞亚群变化的疾病。

　　2 实验方法

　　2.1 试剂和仪器

　　三色荧光抗体CD3CY5,CD4FITC,CD8PE,双色荧光抗体CD4FITC,CD8FITC,购自美国Coulter公司;Th1/Th2检测试剂盒,购自深圳晶美公司。流式细胞仪为美国Coulter公司的ELITE ESP 型。

　　2.2 CITP 患者的T 淋巴细胞亚群的检测

　　无菌采集26例患者和20例正常对照者静脉血2 ml,EDTA 抗凝,加入20 μl三色荧光CD4FITC/ CD8PE/ CD3PECY5试剂,室温避光孵育30分钟,8.3 g/L NH4Cl溶血后以流式细胞仪检测。

　　2.3 T 淋巴细胞内细胞因子检测

　　无菌采集患者和正常对照者静脉血各5 ml,EDTA抗凝,分离外周血单个核细胞,RPMI1640 洗涤并加入等量RPMI1640 培养液稀释后,分别加入PMA、莫能霉素、离子霉素各10 μl,浓度按试剂盒说明配制。充分混匀后送入37℃,体积分数为5%的CO2孵箱培养。将孵育获得的细胞分为4份,每份为100 μl,加抗入CD4FITC、CD8FITC 单抗20 μl/份,室温避光孵育20分钟,10%多聚甲醛固定、5 g/L皂素打孔后加入PE标记的抗人IFNγ单抗和IL4单抗各20 μl/ 份,4℃孵育20分钟,上流式细胞仪检测。分别检测CD4+和CD8+细胞内的IFNγ和IL4 表达,以CD4+/IFNγ和CD4+/IL4+的百分比分别表示Th1和Th2 细胞,同样以CD8+/IFNγ+和CD8+/IL4+的百分比表示Tc1和Tc2细胞。IFNγ+细胞数与IL4+细胞数的比值则代表Th1/Th2 和Tc1/Tc2的值。

　　2.4 统计学处理

　　采用t检验,应用Spss11.0数据统计软件分析实验结果。

　　3 结果

　　3.1 患者外周血T细胞亚群分析

　　与正常对照比较,患者CD3+细胞数明显升高(P<0.01),CD8+细胞显著升高(P<0.05),CD4+/CD8+比值下降并倒置(P<0.05),结果见表1.

　　3.2 细胞内细胞因子的检测

　　与对照组比较,患者Th1细胞数显著升高(P<0.05),Th2细胞下降明显(P<0.05),Th1/Th2比值上升(P<0.05)。与对照组比较,患者Tc1和Tc2较正常对照无明显变化(P>0.05),但Tc1/Tc2显著增加(P<0.05),结果见表2和表3.表1 外周血T细胞亚群分析表2 细胞内细胞因子表3 细胞内细胞因子

　　4 讨论

　　我们的研究结果显示,CITP患者外周血CD3+细胞较对照组明显增加(P<0.01),表明CITP的发病与T淋巴细胞介导的细胞免疫有密切关系。就T淋巴细胞亚群而言,患者CD4+细胞降低,而CD8+细胞明显增加(P<0.05),使CD4+/CD8+比值降低,并且发生倒置。提示CITP患儿外周血T淋巴细胞表面标志表达异常,T淋巴细胞亚群失调。

　　CD4+T淋巴细胞据分泌细胞因子的不同可分为Th1和Th2细胞,它们发挥着不同的功能[2]。Th1细胞主要分泌γ干扰素(IFN γ)、白细胞介素2(IL 2),调节机体的细胞免疫功能。Th2细胞主要分泌IL4、IL5、IL6、IL10等,调节机体的细胞免疫功能。正常机体Th1细胞和Th2细胞彼此影响,处于动态平衡状态,共同维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能[3]。Th细胞之间的失衡与自身免疫病、过敏性疾病、肿瘤、移植排斥反应以及感染性疾病的发生与发展有密切的关系。

　　本次研究显示,CITP患者的Th1/Th2明显高于正常对照组,细胞免疫应答增强,提示机体细胞免疫功能亢进,是一种Th1优势的疾病,这一结论与Panitsas等[4]报道的一致。Th1相关细胞因子如IFNγ等分泌增加,能促进B淋巴细胞分化为浆细胞,分泌免疫球蛋白,从而使血浆中的血小板抗体增加,并促使巨噬细胞对血小板的破坏增加[2]。Th1型反应还促进合成IGg1和IGg3两种亚型的抗体。Vondem Borne等分析CITP患者抗血小板IgG抗体亚型后,发现IGg1占有较大比例为94%,而IGg3为46%,少数为IGg2(2%)[5]。因此Th1优势可能诱导IGg1和IGg3的产生,从而成为破坏CITP患者血小板的自身抗体。

　　CITP患者Tc1和Tc2细胞较正常对照无明显变化,而Tc1/Tc2比值明显增加,提示Tc1/ Tc2比值较Tc细胞数在CITP的发病过程中所起发挥的作用更为明显。活化的Tc1细胞能通过分泌穿孔素、颗粒酶特异性地杀伤血小板。

　　我们的研究表明CITP为Th1优势的疾病。Schorlemmer等[6]用抗IL4单克隆抗体治疗Th亚群细胞失衡的系统性红斑狼疮小鼠,可使小鼠生存率显著提高,生存时间延长。因此在临床上能否采用抗IL4单克隆抗体治疗CITP患者,从而改善Th亚群细胞失衡尚需进一步研究。

【参考文献】
  　[1] Mouzaki A,Theodoropoulou M,Gianakopoulos I,et al.Expression patterns of Th1 and Th2 cytokine genes in childhood idiopathic thrombocytopenic purpura (CITP) at presentation and their modulation by intravenous immunoglobulin G( IV IgG)treatment:their role in prognosis [J ].Blood,2002,100(5):177179.

　　[2] Mosmann TR,Sad S.The expanding universe of T  cell subsets:Th1,Th2 and more[ J ].Immunol Today,1996,17(3):138  146.

　　[3] Altfeld M,Addo MM,Kreuzer K A,et al.T(H)I to T(H)2 shift of cytokines in peripheral blood of HIVinfected patients is detectable by reverse transcriptase polymerase chain reaction but not by enzymelinked immunosorbent assay under nonstimulated conditions [J].J Acquir Immune Defic Syndr,2000,23(4):287294.

　　[4] Panitsas FP,Theodo ropoulou M,Kourak lis A,et al.Adult chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (CITP) is the manifestation of a type1 polarized immune response[J].Blood,2004,103(7):26452647.

　　[5] Monoz Fernandez MA,Fernandez MA,Fresno M.Synergism between tumor necrosis factor alpha and interferon gamma on macrophage activation for the killing of intracellular trypanosoma crusi through a nitricoxide dependent mechanism[J].Eur J Immunol,1992,22:301  307.

　　[6] Schorlemmer H U,Dickneite G,Kanzy EJ,et al.Modulation of the immunoglobulin dysregulation in GVHD and SLE like diseases by the murine IL4 receptor(IL4R)[J].Inflamm Res,1995,44(Suppl 2):194  196.