肾组织移植对慢性肾功能衰竭大鼠促红细胞生成素的调节作用

　　Effect of allograft kidney tissue mass implantation on EPO of rats with chronic renal failure

　　Liu Rongyao1, Wang Dongwen2

　　(1. Department of Urology, the Peoples Hospital of Lüliang, Lüliang 03300; 2. Department of Urology, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study the effect of kidney tissue mass implantation into the capsule of rat kidney on EPO of rats with chronic renal failure. Methods  After the models of chronic renal failue (CRF) induced by adriamyucin were set up in Wistar rats, the kidney tissue mass (1mm3) of newborn Wistar rats were located under the capsule of kidney of the models. During the process of treatment, EPO level in the serum was tested by EPO ELISA kit. Renal pathological changes were observed, and the expression of EPO in transplantation tissue was examined by Immunohistochemical method. Results  ① The levels of EPO (1.160±0.324mU/mL) in the control group were lower than those of the other groups, with the difference being significant (P<0.05). ② The grafts survived and increased in size from 1mm3 to 4mm3 in 60 days, around which there were plenty of newborn blood vessels. Histological examination showed that the grafts had normal structure of glomerule and uriniferous tubules. ③ Immunohistochemical study demonstrated EPO positive grains were located in the region of uriniferous tubules and there were more positive grains in renal tissue of the graft than in that of CRF (P<0.05). Conclusion  Allograft transplantation of kidney tissue mass can ameliorate renal anemia caused by chronic renal failure and might be a new therapeutic means to treat CRFinduced anemia.

　　KEY WORDS: renal tissue transplantation; chronic renal failure; erythopietin; anemia capsule of kidney

　　摘要：目的  研究鼠婴肾组织移植于肾包膜下对促红细胞生成素的调节作用，为临床应用治疗肾性贫血提供理论依据。方法  以Wistar雄性大鼠建立慢性肾功能衰竭动物模型为受体，将鼠婴肾组织块多点植入受体肾包膜下。治疗期间用EPO酶联免疫(ELISA)试剂盒测定血清EPO水平；观察肾组织病理改变,用免疫组化方法检测EPO在移植物中的表达。结果  ①60d时D组血清促红细胞生成素(1.768±0.140)mu/mL高于B组(1.160±0.324)mu/mL(P<0.01)，与C组(2.329±0.125)mu/mL也有差异 (P<0.05)。②移植后60d，移植物的体积由1mm3增至3-4mm3大小，表面血管网丰富，光镜下见肾小球、肾小管结构正常；③移植物EPO免疫组化，发现移植物EPO着色颗粒主要分布于肾皮质的肾小管，明显多于病例对照组大鼠肾组织(P<0.05)。结论  通过对移植物的形态观察和功能测定，证明肾组织移植是一种有效的治疗手段，有可能为慢性肾性贫血提供一种新的途径。

　　关键词：肾组织移植；慢性肾功能衰竭；促红细胞生成素；肾包膜

　　慢性肾衰所引起的贫血(肾性贫血)常常难以改善。其临床重要性越来越受到人们的关注。其主要原因为促红细胞生成素(EPO)分泌不足。目前应用EPO存在价格高、副作用等问题，因此肾性贫血的治疗日益引起人们的重视。此研究采用同种鼠婴肾组织为供体，慢性肾衰雄性大鼠为受体，进行同种肾组织移植的实验。现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  Wistar健康雄性大白鼠，体重(200±20)g，共80只，Wistar鼠婴20只，出生3-4d，雌雄不分，供移植用(由山西医科大学实验动物中心提供，按清洁级标准饲养)。

　　1.2  主要试剂  重组人类促红细胞生成素(2000u/mL，山东阿华医药公司，批号99435；大鼠用量按文献方法折算)。EPO免疫组化试剂(天津TBD生物工程有限责任公司)。F12培养基(Sigma公司)。肌酐和尿素氮试剂盒(北京化康泰公司)。

　　1.3  主要仪器  LD42A台式离心机(北京医用离心机厂)、KJB快速旋涡混匀器(江苏省姜堰市健康医疗器具有限公司)、DK(cu600)电热恒温水温箱(上海医用恒温设备厂)、ELX800酶标仪(美国BIOTEK公司)、UV760紫外可见分光光度仪(上海分析仪器总厂)、OLYMPUS图象分析仪(上海分析仪器总厂)。

　　1.4  实验动物分组与给药  A组：正常对照组(n=20)。B组：病例对照组(n=20)。C组：rHuEPO治疗组30u/kg，腹腔注射，1周3次，连续6周(n=20)。D组：肾组织移植治疗组(n=20)。

　　1.5  动物模型制备  经鼠尾静脉注射盐酸阿霉素6.5mg/kg，三周后行右肾切除，制成稳定的慢性肾功能衰竭大鼠(CRF)模型。

　　1.6  移植方法  用引颈法处死鼠婴，然后把整个小鼠浸入盛有75%(体积分数)酒精的烧杯中；2-3s后取出拭去酒精放入碟皿中，继之在动物腹部用尖刀纵行切开皮肤取婴肾；置入盛有Hanks液的消毒青霉素小瓶中，反复剪切组织至1mm3大小为止(成糊状)；静置使组织下沉，弃上清液，加入37℃的F12培养基待用\[1\]。受鼠用10%(体积分数)水合氯醛4mL/kg体重麻醉后，俯卧并将四肢固定，剪去背部毛发；手术野消毒后切开皮肤、肌肉至显露肾脏，于左侧肾脏腹面横形切口长约3mm；之后用睫状体分离器分离肾包膜使之成囊袋，取10-15块肾组织置于左肾包膜下，小块相互距离为0.5cm，之后用尼龙线缝合包膜，逐层缝合切口。移植后不用免疫抑制剂\[13\]。

　　1.7  标本采集  分别于实验0、15、30、45、60d经大鼠内眦静脉采血做指标检测，60d时处死动物摘除肾脏，观察大体外观，沿肾门纵切，置10g/L甲醛固定，送病检。

　　1.8  观察指标  血清EPO的测定： 分别于实验0、15、30、45、60d经大鼠内眦静脉采血，采用ELISA法直接测定。

　　1.9  统计学处理  采用 SPSS 11.5统计软件，实验的结果采用(±s)表示，各实验组与对照组均数间比较采用混合模型重复测量资料的方差分析。
　　
　　2  结    果

　　2.1  血清BUN Scr测定结果  表1显示实验前病例组、rHuEPO组、肾组织移植组已出现较明显的肾功能减退，与正常组两两比较有显著性差异(P<0.05)，而病例组、rHuEPO组、肾组织移植组两两比较无显著性差异(P<0.05)。

　　表1  A、B、C、D组血清BUN Scr的含量(略)

　　2.2  血清EPO变化  见表2。实验0d B、C和D组EPO水平稍高于正常组，但尚无统计学意义(P>0.05)。30d C和D组的EPO水平比B组显著升高(P<0.01)，随着病程迁延，45和60d C和D组的EPO水平仍高于B组(P<0.05)，但C和D组EPO水平较30d下降(P<0.05)，实验60d C组EPO水平高于D组(P<0.05)。

　　表2  A、B、C、D组血清EPO含量(略)

　　2.3  肾组织EPO免疫组化结果观察  见表3。EPO抗原阳性反应为位于移植物、肾组织的肾小管细胞胞浆内的棕黄色均匀细颗粒，正常组内表达呈强阳性；对照组呈弱阳性或不表达，在移植物中呈强阳性。    

　　表3  EPO半定量分析比较　略

　　3  讨    论

　　经鼠尾静脉注射盐酸阿霉素6.5mg/kg，三周后行右肾切除，移植前测血清BUN显著升高，即造成典型的肾功能衰竭动物模型\[1\]。动物死亡或术后60d处死取肾脏，进行组织病检。HE染色可见局灶性节段性肾小球硬化，肾小管透明管型说明慢性肾功能衰竭模型成功建立\[23\]。实验结果显示30d和60d C和D组EPO水平高于B组。60d C和D组的血清EPO水平低于30d血清EPO水平，也就是在30d达最高值，说明在移植治疗前血红蛋白比较低，通过反馈性调节促进移植组织分泌较多的EPO所致。随着贫血的改善，组织供氧的增加及细胞对氧的适应，产生EPO细胞的数量将发生逆转相应减少\[4\]。D组低于同期C组血清EPO水平，即肾组织移植治疗组大鼠血清EPO水平增高，没有rHuEPO治疗血清EPO水平高，说明肾组织移植治疗是一个持续的给药系统，可能并不需要达到应用重组EPO治疗时的血清EPO水平。这也正是肾组织移植治疗的特点。肾包膜下作为体内的“免疫特许区”或免疫弱反应部位能明显减轻移植物的排斥反应并延长其存活时间。其优点表现在：①肾组织作为供体容易得到、免疫原性降低、培养后可生长、增殖。②肾包膜移植透明性便于观察及标本采取、不干预肾脏的结构和功能、血运丰富容易存活、操作简单。与 rHuEPO疗法相比，同种肾组织移植具有操作简单，可多次进行，价格低以及移植物所分泌的EPO为天然型等优点\[56\]。如选择大动物可借鉴成熟的临床腹腔镜技术较容易地将移植物移植于肾包膜下。综上所述，鼠婴肾组织移植于同种成年鼠的肾包膜下，是一种有效的治疗手段，有可能为慢性肾性贫血提供一种新的途径。

　　参考文献：

　　\[1\]Marc R. Transplantation of embryonic kidneys \[J\]. Clinical Science, 2002, 103:599612.

　　\[2\]Rogers SA, Talcott M, Hammerman MR. Transplantation of pig metanephroi \[J\]. ASAIO J, 2003, 49(1):4852.

　　\[3\]Rogers SA, Hammerman MR. (2001) Transplantation of metanephroi after preservation in vitro \[J\]. Am J Physiol, 281, R661R665.

　　\[4\]赵竹玲，白云安. 应用促红细胞对慢性肾功能衰竭长期血液透析患者的疗效观察 \[J\]. 潍坊医学院学报, 2001, 23(4):319332.

　　\[5\]詹炳炎，章 重. 同种肾组织移植治疗慢性肾功能衰竭性贫血的实验研究 \[J\]. 中华器官移植杂志,1997,18(4):207209.

　　\[6\]王 强,孙淑清.大鼠肾组织包膜下与皮下种植治疗肾性贫血的实验研究 \[J\]. 山西医科大学学报, 2002,33(3):204205.

　　作者简介：刘荣耀(1974)，男(汉族)，硕士，主治医师.Email: lry186@sohu.com   

　　1.吕梁市人民医院泌尿外科，山西吕梁  033000；

　　2. 山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原  030001

　　(编辑  钱春梅)