p53和VEGF在前列腺癌组织中的表达及临床意义

【摘要】  　　目的 研究p53和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在同一前列腺癌(prostate cancer, Pca)组织中的表达及与Pca临床参数的关系，探讨肿瘤血管形成及调节机制。方法 应用免疫组织化学LDP法检测46例Pca组织及20例良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia, BPH)组织中p53蛋白及VEGF的表达。结果 Pca组织中p53与VEGF阳性表达率分别为41.30%(19/46)和71.74%(33/46)，均明显高于BPH组(P<0.05)；p53与VEGF表达呈明显正相关(P<0.05)；二者在Pca组织中的表达水平与其病理分级和临床分期均呈正相关(P<0.05)；p53和VEGF阳性表达的肿瘤复发迅速、易转移，p53阴性而VEGF阳性表达较阴性表达者预后差。结论 p53和VEGF与Pca组织学分级﹑恶性程度和预后密切相关，是检测Pca的较好分子标志物；Pca是典型的血管依赖性病变，p53可能通过p53VEGF调节旁路途径促进Pca的肿瘤血管形成，联合检测p53和VEGF的表达可作为判断Pca生物学行为及预后的重要指标。

【关键词】  前列腺癌　p53基因　血管内皮生长因子　免疫组织化学

　　The expression of p53 and VEGF in human prostatic carcinoma and their clinical significances

　　Yan Hongtao, Gong Baisheng, Dong Dandan, Yang Hong, Chen Zhaoxiang

　　(Department of Urology; Department of Pathology, the Peoples Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610072, China)
　　ABSTRACT: Objective  To study the expression of p53 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in human prostatic carcinoma tissue and their relationship with the clinicopathological parameters, and to understand the role of p53 and VEGF in the progression of tumors. Methods  The expression of p53 and VEGF in 46 cases of prostatic carcinoma and 20 cases of BPH were determined by immunohistochemical LDP methods. Results  The positive expression rates of p53 and VEGF in 46 cases of Pca were 41.30% and 71.74%, respectively. The expression levels of p53 and VEGF in prostatic carcinoma were much higher than those in BPH (P<0.05); the positive correlation was noted between p53 expression and VEGF expression (P<0.05); and both of them were significantly related to the tumor pathologic grades (P<0.05) and tumor clinical stage (P<0.05). Tumors with high levels of p53 that were VEGF positive recurred earlier and had a greater risk of stage progression than those with low levels of p53 and VEGF negative. The high levels of VEGF also indicated the poorest prognosis in p53 negative tumors than those with low levels of VEGF. Conclusion  This study indicates that p53 and VEGF are closely related to the histopathological grading, the tumor differentiation and prognosis of Pca. p53 and VEGF are good molecular markers of Pca. The pathological changes in the tumor are typically vessel dependent, and vascularization is favourable to tumor growth, infiltration and recurrence. Mutanttype p53 protein accumulation may be associated with tumor angiogenesis through the way of VEGF upregulation. The combined detection of p53 and VEGF may serve as an important index to estimate the biological behavior and prognosis of Pca.

　　KEY WORDS: prostatic carcinoma; p53 gene; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry
　　

　　前列腺腺癌(prostate cancer, Pca)是老年男性常见的恶性肿瘤之一，血管形成是肿瘤生长和转移的基础[1]。肿瘤血管生长的调控是一个复杂的机制，其中，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前公认为刺激肿瘤血管生长的最主要的因子。而VEGF的表达又受多种因素调节。p53基因是一种肿瘤抑制基因，近年来有学者报道，突变型p53基因通过调节肿瘤组织VEGF的表达水平，具有促进肿瘤血管形成的作用[2]。说明突变型p53与VEGF的表达密切相关。有关Pca中p53与VEGF表达的相关性的研究国内外报道较少。为此，我们采用免疫组织化学标记菌葡萄聚糖聚合物法(labeled dextran polymer method, LDP法)检测了Pca组织中p53与VEGF的表达情况，并对它们表达的关系及临床意义作了初步探讨。

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料  选自我院泌尿外科1997年1月至2005年1月间经病理证实的46例Pca患者作为研究对象，年龄51-83岁，中位年龄69岁。按WHO病理学分级标准，G1级6例，G2级14例，G3级26例；按国际TNM临床分期标准(UICC，1997年)将46例Pca分为二组：T1-T2期15例，T3-T4期31例。另取20例良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia, BPH)作为对照，所有组织均为同期手术标本(包括经尿道电切的前列腺组织块、前列腺摘除标本、前列腺癌根治术及前列腺穿刺活检的标本)，所有患者术前均未接受放疗和化疗。标本经10%(体积分数)甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚切片备染。2005年12月终止随访，随访时间12-96个月，平均(46±4.2)个月。

　　1.2  试剂与方法  实验用鼠抗人p53单克隆抗体(工作浓度1∶100)﹑单抗VEGF(工作浓度1∶100)及EnvisionTM试剂盒均为DAKO公司产品。采用免疫组织化学LDP法进行检测，染色步骤按试剂盒说明分别进行，分别选用已知阳性组织切片作阳性对照，用PBS液分别代替一抗作阴性对照。

　　1.3  结果判定  p53表达的判定：p53蛋白阳性着色细胞表现为细胞核显棕黄色，切片中阳性细胞率≥10%者为p53染色阳性，<10%为阴性。VEGF表达的判定：肿瘤细胞胞浆出现棕黄色颗粒即为VEGF阳性染色。我们以两方面评分：阳性染色深度(未着色0分，轻度着色1分，中度着色2分，重度着色3分)和阳性细胞百分比(无阳性细胞0分，阳性细胞<25%为1分，25%-50%为2分，>50%为3分)，这两方面相加，得分0-2分者为阴性表达，3-6分者为阳性表达。

　　1.4  统计学处理  组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  p53、VEGF在Pca组织及BPH组织中的表达(表1)  p53在Pca与BPH组织中表达存在统计学差异(P<0.05，图1、图3-4)；VEGF在二组中表达亦具有显著性差异(P<0.01，图2、图5-6)。

　　图1  前列腺增生症(BPH)，p53呈阴性表达  LDP法×200（略）

　　图2  前列腺增生症(BPH)，VEGF呈阴性表达  LDP法×200（略）

　　图3  前列腺癌，p53呈阳性表达()(箭头指示处)  LDP法×200（略）

　　图4  前列腺癌，p53呈阴性表达  LDP法×200（略）

　　图5  前列腺癌,VEGF呈阴性表达  LDP法×200（略）

　　图6  前列腺癌，VEGF呈阳性表达()(箭头指示处)  LDP法×200（略）

　　2.2  p53、VEGF的表达与Pca临床病理学特点的相关性(表2)  p53的表达在临床分期T3-T4期组和T1-T2期组之间差异显著(P<0.01)。在G1、G2、G3级癌组织中，各组间p53蛋白的表达比较无统计学意义(P>0.05)，但G1+G2组与G3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示分化程度越低，p53蛋白阳性表达率越高。

　　表1  p53、VEGF在Pca与BPH组织中的表达（略）

　　与BPH组织比较*P<0.05,**P<0.01

　　表2  Pca癌组织中p53、VEGF的表达与Pca临床病理特点的相关性（略）

　　VEGF的表达与Pca病情发展及肿瘤细胞的分化程度关系密切，VEGF的阳性表达率随组织学分级增高呈升高趋势。G1与G2比较无统计学意义(P>0.05)，G1与G3﹑G1+G2与G3比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。高分期组(T3-T4期)VEGF表达明显高于低分期组(T1-T2期)，差异有统计学意义(P<0.05)。表明Pca组织中VEGF的表达水平与Pca的病理分级和临床分期均呈正相关。

　　2.3  Pca组织中p53表达与VEGF表达的关系(表3)  连续切片对比分析发现，在VEGF表达较高的区域，p53表达亦较强，两者在Pca中表达一致的符合率达60.9%，相关分析显示，两者表达具有相关性(P<0.05)。
   
　　本研究结果还发现，p53表达阳性的19例Pca组织中VEGF的阳性表达率为89.5%(17/19)，p53表达阴性的27例Pca组织中VEGF的阳性表达率为59.3%(16/27)，前者明显高于后者，其差异有统计学意义(P<0.05)。

　　表3  p53与VEGF表达的关系（略）

　　对有完整随访资料的患者研究表明，p53与VEGF阳性表达患者的术后生存期明显低于p53、VEGF阴性表达者。
 
　　3  讨论

　　3.1  p53基因在Pca中表达的意义  p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。本研究结果表明，p53蛋白阳性表达率为41.3%，提示Pca肿瘤组织中有p53蛋白存积(还可能与本组所选择病例大多为中晚期患者有关)。并且发现p53蛋白阳性表达随细胞分化恶化程度呈递增趋势，与病理分级密切相关，p53蛋白积累量随着Pca恶性程度的增大而逐渐增多。突变的p53的过度表达不仅揭示了Pca发生与发展的可能机制，而且与Pca细胞恶化有直接关系，更可能是肿瘤发生的晚期事件，同时，也提示p53基因表达可作为前列腺良恶性疾病鉴别的一种方法[3]。随访发现：治疗前，肿瘤分化越差，p53蛋白阳性率越高，对治疗的有效性越差，复发的可能性就越大，预后差。反之，则治疗有效性好，预后好。我们认为，p53蛋白的过度表达是Pca高度恶性和预后不良的重要指标之一[4]。而且p53蛋白还可能作为一个开关蛋白，上调VEGF的表达，促进肿瘤新生血管生成。

　　3.2  VEGF在Pca中表达的意义  VEGF是目前已知的一簇最强的促血管形成物质，在许多恶性肿瘤组织中高表达。它可以通过与血管内皮细胞膜上的受体结合而发挥其内皮相关功能，促进内皮细胞的分裂、游走和增殖，诱导宿主毛细血管新生并长入肿瘤组织，是肿瘤新生血管形成的决定因素之一[5]。而肿瘤组织中VEGF的高表达又可能为其继续生长和转移提供必要的内在条件。肿瘤自肿瘤血管从宿主获得营养，并通过不成熟的肿瘤血管向宿主输出大量恶性细胞，导致肿瘤不断生长和转移。由此可见，VEGF在肿瘤血管生长和调节肿瘤细胞增殖过程中起着十分关键的作用。
   
　　本组研究结果显示：VEGF在Pca组中表达强度明显大于BPH组(P<0.01)，这与VEGF能特异性的刺激血管内皮细胞增殖，并通过增加血管通透性和刺激新生血管的形成促使肿瘤生长有关[6]。从本组的研究结果中发现，VEGF在Pca中的阳性表达率为71.7%，G1、G2、G3级Pca的阳性表达率分别为16.7%、50.0%、96.2%，G1与G3级之间，G1+G2级与G3级之间比较差异均有统计学意义。显示VEGF的阳性表达率及表达强度随着Pca组织学分级的增高而增加，说明VEGF的表达与Pca的分化程度密切相关。在临床分期T3-T4期Pca组织中VEGF的表达明显高于T1-T2期Pca组织，即VEGF的表达程度也随着Pca临床分期的增高而增加(P<0.05)，说明VEGF与Pca的侵袭能力有关。以上结果表明：VEGF的表达与肿瘤的组织学分级﹑临床病理分期及预后有明显的相关性，在肿瘤的生长侵袭﹑转移过程中起着相当重要的作用，提示VEGF表达的检测可作为Pca病期进度评估的一项重要指标。

　　3.3  p53与VEGF表达的相关性及临床意义  有研究报道p53基因对VEGF、血小板反应素1(TSP1)等血管生成调节因子的表达有调控作用[2，78]，本研究也发现p53的表达与VEGF表达呈显著正相关。研究表明，p53基因在VEGF介导的肿瘤血管形成方面起重要作用。Giatromanolaki等[9]发现，野生型p53参与下调内源性VEGF mRNA水平及VEGF启动子的活性，而且VEGF的表达有赖于野生型p53基因的丢失。Bouvet等[10]在对转染细胞模型进行VEGF诱导血管形成研究时，发现1条p53调节VEGF通路，突变型p53可上调VEGF的表达，从而促进肿瘤新生血管的形成。本研究中，p53表达阳性的Pca组织中VEGF的阳性表达率为89.5%，明显高于p53阴性的Pca组织(P<0.05)，且p53和VEGF表达一致的符合率达60.9%，相关分析显示二者表达具有显著正相关(P<0.05)。表明p53突变可能作为一个开关蛋白，上调VEGF的表达，促进其合成，并进一步促进肿瘤的微血管形成。
   
　　本研究还发现，Pca中p53和VEGF同时阳性表达多发生在分化差和晚期肿瘤中，且对有完整随访资料病例的研究发现，p53和VEGF阳性或同时表达阳性的患者，术后复发迅速，病程进展快，易发生远处转移，术后生存期明显低于p53和VEGF阴性表达者。p53阴性而VEGF阳性表达者较阴性表达者预后差，提示在p53阴性表达时VEGF阳性表达可作为判断Pca早期复发﹑转移及预后的一个有效指标。而突变型p53蛋白与VEGF均可能参与了肿瘤血管形成的调控，即在促进肿瘤新生血管形成的机制中存在协同作用[4]。
   
　　关于p53基因对肿瘤血管形成的调控机制，目前有学者认为突变型p53蛋白可通过减少凝血栓蛋白(Thrombospontin, TSP1)或增强蛋白激酶C的活性使VEGF的表达量增加等来促进肿瘤新生血管的形成[11]。
   
　　本研究提示p53蛋白的表达水平和VEGF的表达呈正相关(P<0.05)，结合文献报道，我们推测，p53蛋白是VEGF表达的重要调控因子之一，但VEGF的表达同时还存在其他调控方式。

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　　[9]Giatromanolaki A, Koukourakis MI, Kakolyris S, et al. Vascular endothelial growth factor, withtype p53, and angiogenesis in early operable nonsmall cell lung cancer [J]. Clin Cancer Res, 1998, 4(12):30173024.

　　[10]Bouvet M, Ellis LM, Nishizaki M, et al. Adenovirusmediated wildtype p53 gene transfer downregulates vascular endothelial growth factor expression and inhibits angiogenesis in human colon cancer [J]. Cance Res, 1998, 58(6):22882292.

　　[11]Gautam A, Densmore CL, Melton S, et al. Aerosol delivery of PEIp53 complexes B16F10 lung metastases through regulation of angiogenesis [J]. Cancer Gene Ther, 2002, 9(1):2836.

　　(编辑 刘 华)

作者单位：四川省人民医院：泌尿外科；病理科，四川成都 610072