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［摘要］目的构建并筛选携带针对Epstein-Barr病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆。方法 用DNA重组技术，将60 bp能转录产生靶向LMP1小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列，定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro，脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317，G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。结果重组逆转录病毒载体经限制性 内切酶酶切，电泳后可观察到7167bp和281 bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染包装细胞。可表达绿色荧光蛋白，经G418筛选，得到抗性细胞克隆。结论 特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建和筛选成功。
［关键词］shRNA;LMP1;PA317;逆转录病毒载体;Epstein-Barr病毒
CONSTRUCTION OF pSUPER RETRO RNAi SYSTEM OF THE SPECIFIC SILENCING EBV LATENT MEMBRANE GENE LMP1
YIN FAN， WANG XIAO-FENG， LUO BING
（Department of Microbiology， Qingdao University Medical College，Qingdao 266021，China） ［ABSTRACT］ Objective To construct and identify a recombinant retroviral vector pSUPER-LMP1 that target EBV latent membrane protein gene 1 （LMP1） and a stable virus-producing cell line. Methods The 60 bp encoded targeting LMP1 gene shRNA sequence was cloned into a retroviral vector pSUPER retro with DNA recombinant technique. The recombinant vector was identified by the electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The packaging cell PA317 was trans-fected with this recombinant plasmid using liposome-based transfection and the stable intergrant was selected by using G418 me- dium. Results The electrophoresis of EcoRⅠand HindⅢ digested products showed two DNA fragments， 7 167 bp and 281 bp，respectively. The result of sequence demonstrated that 60 bp had been inserted into the vector. Green fluorescent protein （GFP）was observed after transfection. G418 resistant clones were also selected. Conclusion A recombinant retroviral vector pSUPER- LMP1 and a stable virus-producing packaging cell line were successfully constructed and identified.
［KEY WORDS］shRNA;LMP1;PA317;retroviral vector;Epstein-Barr virus
Epstein-Barr病毒（EBV）是重要的DNA肿瘤病毒，与人类多种淋巴系统恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、移植后B淋巴细胞瘤、霍奇金病及某些T淋巴细胞瘤等的发生密切相关;并参与某些上皮性肿瘤的发生，其与鼻咽癌的关系早已得到确认。近年来研究表明，胃癌、肝癌和口腔癌组织中可检测到EBV基因组［1，2］。因此，国际癌症研究署（IARC）最近已将EBV列为第一类致癌因子。在众多EBV编 码蛋白中，潜伏膜蛋白LMP1已被证明能恶性转化原代B细胞、鼠成纤维细胞和人上皮细胞，其编码基因是公认的病毒癌基因。
本研究选择LMP1作为靶基因，应用RNA干涉（RNAi）技术，构建携带针对LMP1基因的pSU-PER retro neogfp-LMP1重组载体，以特异性沉默 EBV阳性肿瘤细胞中LMP1基因表达，观察小发夹RNA（shRNA）对靶基因表达的抑制作用，以及靶基因沉默对EBV阳性肿瘤细胞凋亡和增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系和质粒
逆转录病毒包装细胞PA317购自中国典型培 养物保藏中心;大肠杆菌JM109为本实验室保存菌种;pSUPER retro neo+gfp质粒购自美国Oligo Engine公司，靶向EBV LMP1的60 bp oligos由美国Oligo Engine公司合成。
1.2 主要试剂
限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自大连宝生物有限公司;QIAquick PCR Purification kit购 自德国QIAGEN公司;脂质体转染试剂Lipofectine 2000和G418购自美国Invitrogene公司。
1.3 实验方法
1.3.1 靶向LMP1基因寡核苷酸的设计
应用美国Oligo Engine公司提供的双链RNA（siRNA）设 计软件，将LMP1的基因序列号D10059输入后，该 软件自动选择合适的19 nt靶序列，并主动通过 Blast搜索确认与人的基因序列无同源性。
上述每条链的黑体字序列即为19 nt的靶序列，二段黑体字序列反义互补，中间为9 nt的spacer区相隔，两端为保护碱基以及BglⅡ和HindⅢ酶切黏性末端，可与BglⅡ和HindⅢ酶切后的pSUPER retro载体进行连接。
1.3.2 载体的选择
本研究选用美国Oligo En-gine公司的pSUPER retro neo+gfp质粒作为载体，该载体有BglⅡ和HindⅢ两个酶切位点，两位点之间为983 bp的填充序列，将该填充序列切下 后，与上述合成的具有BglⅡ和HindⅢ黏性末端的60 nt的寡核苷酸双链连接，构成重组质粒。该质粒含有RNA聚合酶ⅢH1启动子，可转录产生针对靶序列的shRNA;该质粒的报告基因绿色荧光蛋白基因（gfp基因）和新霉素抗性基因（neo基因）可用于阳性克隆的筛选。
1.3.3 寡核苷酸与pSUPER载体的连接
将带有BglⅡ和HindⅢ酶切黏性末端的60 nt正义和反义寡核苷酸分别溶于无菌无核酸酶的水中，使其终质 量浓度为3 g/L;各取1 μL加入48 μL退火缓冲液中，依次94 ℃ 4 min，80 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，37 ℃ 20 min，最终缓慢冷却至室温进行退火反应。用限制性核酸内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切pSU- PER载体，先加入HindⅢ作用60 min，再加入Bgl Ⅱ继续反应2 h，然后65 ℃ 20 min终止反应。酶切产物于8 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，长波紫外线灯下切取7 388 bp的大片段，用QIAGEN QIAquick PCR Purification kit回收，得到带有BglⅡ和HindⅢ黏性末端的线性化载体。用T4 DNA连接酶分别进行连接反应，靶向LMP1寡核苷酸与pSUPER 载体连接后构建的重组载体命名为pSUPER-LMP1;对照错义LMP1-M寡核苷酸与pSUPER载体连接后构建的重组载体命名为pSUPER-LMP1-M。
1.3.4 连接产物的转化
应用1×TSS两步法，将上述连接产物转化至新鲜制备的E.coli JM109感 受态细菌中，ALB平板（含氨苄青霉素100 mg/L）上培养18～24 h，选取10～20个中等大小菌落，在含ALB液体培养基中37 ℃振摇16 h，碱裂解法小量提取质粒DNA。
1.3.5 重组载体的酶切鉴定
用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pSUPER-LMP1和pSUPER- LMP1-M以及对照空质粒，37 ℃水浴过夜，次日各取10 μL于10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中观察电泳结果。该载体在插入片段的两侧分别有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点，这两个位点之间的片段长为1 204 bp，而重组质粒是将空质粒预先用HindⅢ和BglⅡ切下983 bp的片段，再插入 60 bp寡核苷酸链，所以阳性克隆酶切后可观察到281 bp条带。
1.3.6 测序鉴定
为进一步验证序列的准确性，设计一对引物，扩增产物为包括插入序列及其两侧部分碱基的一段长度为384 bp的核苷酸，引物序列如 下:pPSUPER-a:5′-CCCTTTATCCAGCCCT- CACTCC-3′，pPSUPER-s:5′-GAAAAGCGCCTC- CCCTACC-3′。以重组质粒pSUPER-LMP1为模板进行PCR反应。扩增产物送上海生物工程有限公司测序。如果为阳性克隆，扩增产物为384 bp，并含有60 nt的插入序列。
1.3.7 转染包装细胞系PA317 双嗜性逆转录病毒包装细胞系PA317培养液分别含体积分数0.10 的胎牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素100 g/L的DMEM，37 ℃，含体积分数0.05的CO2温箱中培养。当细胞汇合度达80%～90%时，按说明书利用 脂质体Lipofectine 2000（Invitrogene）将重组质粒pSUPER-LMP1导入PA317细胞，48 h后，在倒置 荧光显微镜下观察绿色荧光。使用2.5 g/L的胰蛋 白酶消化细胞，以1∶5传代培养，24 h后换含G418（600 mg/L）的选择性培养基。3～4 d后换液，8～10 d后对照细胞（未转染细胞）全部死亡;倒置荧光显微镜下观察成功转染的细胞均出现绿色荧光，换用新鲜的G418（600 mg/L）选择性培养基培养2～3 d后 ，改用G418（200 mg/L）培养基维持培养，直至阳性克隆形成。
2 结 果
2.1 pSUPER retro neo+gfp质粒双酶切后的电泳结果
该质粒全长8 371 bp，BglⅡ和HindⅢ两酶切 位点之间的序列为983 bp，所以用BglⅡ和HindⅢ 将质粒双酶切后，可观察到983 bp和7 388 bp的 DNA片段。见图1。
2.2 重组质粒的酶切鉴定
选取ALB平板上的可疑菌落摇菌后提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，取10 μL酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，并选取空质粒作为对照。电泳结果显示，空质粒和重组质粒均观察到7 167 bp的 DNA条带，但空质粒酶切产生的较小的DNA片段为1 204 bp，而重组质粒pSUPER-LMP1和pSU- PER-LMP1-M则为281 bp（图2）。
2.3 靶序列鉴定
重组质粒pSUPER-LMP1的PCR产物测序结果与我们设计合成的EBV LMP1-1 HIND链的序列完全一致，表明60 bp的寡核苷酸插入pSUPER 载体，靶向EBV LMP1基因的pSUPER-LMP1载体构建成功。
2.4 逆转录病毒载体的包装
重组质粒pSUPER-LMP1经脂质体法转染包装细胞PA317， 48 h后在倒置荧光显微镜下观察到有绿色荧光出现。经G418筛选，获得阳性细胞克隆。见图3。
3 讨 论
EBV潜伏膜蛋白基因LMP1是公认的导致细胞恶性转化的病毒癌基因，LMP1高水平表达可诱发细胞癌变，在B淋巴细胞的体外转化中起重要作用，还可抑制人上皮细胞的分化，诱导人上皮细胞和大鼠细胞在裸鼠体内形成肿瘤，并可通过激活A20基因阻断p53介导的细胞凋亡［3］。因此，有效抑制LMP1的表达，有望应用于EBV相关肿瘤的治疗。RNAi是自然界中普遍存在的一种重要的转录后基因沉默（PTGS）现象，采用人工合成的19～23 nt siRNA直接转染或shRNA经载体介导后转染靶细胞可诱导RNAi，能产生对相应序列mRNA的特异性降解［4，5］ 。鉴于EBV潜伏期基因LMP1可导致细胞癌变，并且可与细胞癌基因协同作用参与EBV相关肿瘤的发生发展，故可作为选择性干预的靶基因。目前，制备siRNA的方法主要有两类，即体外制备和体内表达，两者最大的不同在于前者直接作用于RNA，而后者的对象则是DNA。根据具体工具不同可进一步划分为5种RNAi实验方法，即化学合成法、体外转录法、制备siRNA混合物、siRNA表达盒子（SECs）和siRNA表达载体法。化学合成法是体外制备siRNA，这种方法比任何其他方法都要昂贵，而且周期较长，一般根据不同的合成和纯化 要求需要4～12 d。体外转录法同样是体外制备siRNA，但利用此法得到的siRNA产量有限，不适合大量制备siRNA以进行长期研究。制备siRNA 混合物的原理是利用RNaseⅢ酶消化dsRNA，应用得到的混合物进行转染，因此也有人形象地称之为鸡尾酒法［6］，上述三种方法的作用时间都比较短。siRNA 表达盒子是PCR引发siRNA表达模板，SECs依次包含RNA聚合酶启动子、编码shRNA 的模板DNA序列和RNA聚合酶终止位点［7］。只要将带有EcoRⅠ和HindⅢ限制性位点的RNA聚合酶启动子和终止子的PCR引物，与合成的模板DNA序列在体外进行PCR扩增，即可得到大量SECs。将PCR扩增后的SECs插入表达载体中，直接转染至哺乳动物细胞，可以在体内引发功能性的siRNA的表达，从而介导目的基因抑制。SECs不像siRNA那样易于转染细胞，如果不克隆入质粒，KSECs不易扩增。siRNA表达载体法的特点是由RNA聚合酶启动子（polⅢ）启动体内的转录，另外有4～5个T组成的转录终止位点，常用RNA聚合酶启动子包括人和鼠的U6启动子以及人H1启动子等3种。选择RNA polⅢ是因为它总是在离启动子固定距离的位置开始转录，遇到4～5个连续的U 即在转录终止位点的第2个碱基处终止，非常精确［8］。由于质粒可以在细胞内复制扩增，这种带有抗生素抗性标记的载体抑制基因，表达的效果可持续几周甚至更长，这使之成为适用于较长周期研究的方法。
本研究采用逆转录病毒转染体系构建针对EBV潜伏期膜蛋白LMP1的shRNA转录载体。携带靶序列的pSUPER-LMP1载体是带有新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白编码基因的逆转录病毒载体，该载体带有依赖RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子，可转录生成针对靶基因的shRNA，在体内再加工生 成双链的小干涉RNA，进而降解相应的靶mRNA。逆转录病毒能感染分裂期细胞，使目的基因稳定地 整合到靶细胞基因组，能长期表达，而且不产生辅助 病毒，具有很好的安全性。本研究通过脂质体转染双嗜性包装细胞PA317，包装成功的PA317细胞在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，说明转染成功。经G418筛选，获得可以长期提供感染靶细胞的逆转录病毒，该病毒能产生针对靶基因LMP1的shRNA，使靶基因的mRNA降解，为更深入地探讨LMP1基因沉默对EBV阳性肿瘤细胞凋亡和增殖分化的影响，进而用于EBV相关肿瘤的治疗奠定了实验基础。
［参考文献］
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［8］ SUI G，SOOHOO C，AFFAREL B， et al. A DNA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mam- malian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002，99（8）: 5515.
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（30471623）
（青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266021）