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【摘要】 目的 观察冬凌草甲素对肝癌细胞株体外的放射增敏作用。方法 对肝癌细胞系（HepG2）进行克隆形成实验。照射前用1.804、3.608、5.412、7.216、18.040 μmol/L冬凌草甲素处理HepG2细胞6～72 h，然后分别给予0、1、2、3、4、5、6 Gy的 60Co照射，观察细胞存活率，计算放射增敏比(SER)。 并运用常规照射剂量2 Gy时的放射增敏比(SERSF2)作为评价指标。 结果 冬凌草甲素可提高 HepG2细胞的放射敏感性，并呈时间、浓度依赖关系。照射前用1.804 μmol/L 冬凌草甲素处理HepG2细胞6～72 h，在6、12和24 h未观察到放射增敏作用，放射增敏作用仅在48和72 h出现。当高浓度冬凌草甲素(18.040 μmol/ L)处理HepG2细胞6、12和24 h,各时间点均可见放射增敏效应。结论 冬凌草甲素可能是一种肝癌放射增敏剂。
【关键词】 冬凌草甲素 辐射增敏药 细胞系 肿瘤 辐射增敏
RADIOSENSITIZATION EFFECT OF ORIDONIN ON HepG2 IN VITROWANG HAO, YU HONGSHENG, XUE HONGWEI （Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China） ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the radiosensitization effect of Oridonin on hepatic cancer cell lines (HepG2) in vitro. MethodsClonogenic assay was used to get HepG2 cell line. Different doses of oridonin (1.804,3.608,5.412,7.216 and 18.040 μmol/ L) were used to treat HepG2 cells for 6-72 h, before radiation of 60Co in doses of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 Gy, respectively. The survival fraction was observed, the sensitization enhancement ratio (SER) calculated, and changes in radiosensitivity was estimated by SER at a clinically relevant dose of 2 Gy (SERSF2).ResultsOridonin enhanced the radiosensitivity of HepG2 cells in a timeand dosedependent manner. Enhancement of radiosensitivity was observed at 48 h and 72 h after treated with low dose of oridonin (1.804 μmol/L). High dose of oridonin (18.040 μmol/L) produced early radiosensitivity effect observed at 6, 12 and 24 h.ConclusionOridonin might be a potential radiosensitizer in hepatic cancer cell lines.
［KEY WORDS］oridonin; radiationsensitizing agents; cell line, tumor; radiosensitization.
冬凌草甲素是从冬凌草中提取的贝壳杉烯二萜类化合物。以往的研究表明，冬凌草甲素具有促进肿瘤细胞凋亡的作用[1]。而细胞凋亡速率被认为能影响肿瘤的放射敏感性[2]。因此，本研究应用克隆形成法研究冬凌草甲素对肝癌细胞株（HepG2）的体外放射增敏效应，以评价冬凌草甲素是否有肝癌体外放射增敏作用。
1 材料和方法
1.1 药物及细胞来源
冬凌草甲素（Oridonin）由中国科学院昆明植物研究所提供。人肝癌细胞系（HepG2）从ATCC公司购买。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞在37 ℃体积分数0.05的CO2孵育箱中培养24～30 h。
1.3 细胞照射和克隆形成分析
指数生长期细胞传代于培养瓶,在孵箱中培养24 h,加入不同浓度的冬凌草甲素(1.804、3.608、5.412、7.216、18.040 μmol/ L),再培养不同时间(6、12、24、48、72 h)。然后用胰酶消化细胞,重悬于新鲜培养液中,并将细胞种植于含有10 mL培养液的平皿中。3 h后,细胞贴壁于平皿,在室温下用剂量率为6 mGy/min的 60Co源照射,并给予不同的剂量（0、1、2、3、4、5、6 Gy）。照射后,平皿在含体积分数0.05 CO2的37 ℃恒温孵箱中培养14 d。14 d后,细胞经乙醇固定、染色并计数。以细胞数≥50个的集落作为存活克隆。克隆形成分析得到的所有数据,均校正冬凌草甲素产生的细胞毒性,以校正冬凌草甲素内在细胞毒性对存活分数(SF)的影响。每组实验均重复3次,独立完成。实验数据以±s表示,存活曲线用单靶多击模型拟合,计算出对照组和药物处理组的平均致死量（D0）和准阈剂量（Dq）。放射增敏比(SERD0、SERDq) 根据D0和Dq值分别计算,定义为对照组D0或Dq 除以药物处理组D0或Dq。放射增敏性以常规照射剂量2 Gy时的放射增敏比(SERSF2) 表示，定义为2 Gy时对照组SF和药物处理组SF之比。
2 结 果
较低浓度冬凌草甲素（1.804 μmol/L）在较短的处理时间内（6、12、24 h）均未观察到放射增敏作用。当作用时间为48 h时观察到放射增敏作用，72 h 时放射增敏作用明显增强。
较高浓度冬凌草甲素（18.040 μmol/L）处理HepG2细胞6、12、24 h后，均可以观察到放射增敏作用。并且随着作用时间的延长，其放射增敏作用明显增强。
高浓度（18.040 μmol/L）冬凌草甲素相应时间的增敏效果要明显高于低浓度（1.804 μmol/L）。分别用3.608、5.412、7.216 μmol/L冬凌草甲素处理HepG2细胞48 h， SERSF2随着浓度增加而明显提高。见表1。表1 不同浓度冬凌草甲素作用于HepG2的放射增敏比
3 讨 论
肝癌治疗的首选方法是外科手术,也强调多种技术的综合和序贯治疗,因此放疗在肝癌治疗所占的比重随着外科技术和放射技术的不断发展而不断提高。而肝癌的放疗一直以来面对肝细胞的耐受量低于肝癌细胞的根治量的难题，这对矛盾一直困扰着临床工作者。肝癌常规根治剂量需要60 Gy(30次,6周左右),而肝脏的全肝放射耐受量3～5周仅为25～40 Gy[3]，若有肝硬化则耐受剂量更低[4],局部小野的耐受量为55 Gy(6周)。
怎样使肝癌的根治剂量大于肝细胞耐受剂量，就成为了世界级的难题。已有的研究分别从三维适形放疗（3DCRT）、适形调强放疗（IMRT）技术及改变吸氧方式等角度试图解决问题[5,6]，而目前还没有专门针对肝癌细胞的放射增敏剂的报道。因此，我们试图通过药物增敏从而提高肝癌细胞的放射敏感性的角度解决这个难题。
冬凌草甲素是从中药冬凌草中提取的一种二萜类化合物，并且最近在体外实验中被证明能够抑制肝癌细胞及其他多种人类恶性肿瘤细胞的增殖作用[1，7]。最近的体外和临床实验研究显示,冬凌草甲素对肿瘤细胞具有多方面的作用[8]，包括抑制增殖，促进瘤细胞分化，抑制瘤细胞转移，以及瘤细胞停滞作用[9]。
众所周知，放射敏感细胞周期为G2/M期。而冬凌草甲素可阻滞细胞M→G1或M→G1和G2→M的进程,导致G2/M比例的增加[10]。因此，我们选择冬凌草甲素作为研究对象，以期验证其是否具有针对肝癌细胞的放射增敏作用。实验结果提示，冬凌草甲素增加HepG2细胞的放射敏感性，并呈时间、浓度依赖关系。随着冬凌草甲素浓度的增加，放射敏感性提高；相同浓度的冬凌草甲素作用于肝癌HepG2细胞时间越长，肝癌细胞的放射敏感性就越高。因此，冬凌草甲素浓度越高所需要作用于肝癌细胞的时间也就越短。
本实验初步证实了冬凌草甲素是一种潜在的肝癌放射增敏剂。根据现有的实验结果来看，其既有体外抑制肝癌细胞增殖的作用[1]，又具备对肝癌细胞体外放射增敏的作用。如果经过动物实验和人体实验证实其在体内也具有这两方面作用，冬凌草甲素则可以在肝癌的治疗中发挥一定的作用。
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作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003