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【关键词】 乳腺肿瘤 基因 RASSF1A 甲基化
随着人们对肿瘤的深入研究，发现多数实体肿瘤存在 3 号染色体短臂(3p)缺失，提示 3p 区域所含的基因对肿瘤发生发展起着重要作用，可能隐含肿瘤抑制基因。因此，人们从染色体3p上发现了BLU、FUS1、RASSF1A等抑癌基因。现将RASSF1A甲基化在乳癌中的研究进展综述如下。
1 RASSF1A及其相关基因的介绍
2000年，LERMAN等利用肺癌和乳癌细胞株成功地克隆了一个新基因——RASSF1， RASSF1基因与 Ras 的效应基因同源，位于3p，确切的位置是3p21.3，全长7.6 kb，内含8个外显子（1α、1β、2αβ、2γ、3、4、5、6）[1]。研究发现，由于使用不同的剪接和启动子，该基因存在A～E 5种不同的转录本,主要为A、B、C 3种转录本。RASSF1A含有6个外显子（1α、2αβ、3、4、5、6），其cDNA全长1 873 bp，含340个氨基酸的开放读框，编码产物为相对分子质量388 000的蛋白质多肽。其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源，即蛋白激酶保守区域Ⅰ。C端与鼠的Ras效应蛋白Norel和鼠蛋白Maxpl高度同源。转录因子RASSF1B主要在造血细胞中表达，在其他系统细胞中表达较少，因此它在肿瘤中的作用不大。RASSF1A和RASSF1C在所有正常组织中均表达，但是在包括乳癌在内各种不同的肿瘤中，抑癌基因RASSF1A是失活或突变的。在乳腺肿瘤病人中RASSF1A基因发生改变的频率还没有统计。SEIDEL[2]研究了RASSF1A甲基化与乳癌危险因素的关联，结果显示RASSF1A基因甲基化位点有codon28和codon133，但乳癌的发生主要与该基因在位点codon133的甲基化有很大关系。在缺失RASSF1A表达的肿瘤细胞中使用甲基化抑制剂并重新表达RASSF1A后，可以减少细胞克隆、阻止肿瘤形成，RASSF1A作为一个潜在的抑癌基因而被发现。
2 RASSF1A在肿瘤中的作用机制
RASSF1A作为抑癌基因，在抑制肿瘤的发生和发展中的具体作用机制尚不很清楚。一种可能是一方面RASSF1A的失活导致Ras作用的失衡，使其主要发挥促进生长的作用；另一方面RASSF1A基因通过抑制Ras激活生长效应信号的传导途径而促进细胞的凋亡、衰老、坏死和终末分化。RASSF1A基因可能就是编码Ras的一种特有的效应蛋白，它的失活破坏了Ras的平衡作用，从而导致了细胞的恶性转换[3]。另一种可能是RASSF1A通过抑制细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)的积聚而抑制恶性肿瘤形成。研究结果表明，RASSF1A在翻译控制水平上，通过抑制CyclinD1的积聚而阻止细胞周期G1期向S期的转变，但CyclinD1及其下游激活因子自表达的增多又可抑制RASSF1A诱导细胞周期的停止[4]。因此，RASSF1A作为抑癌基因，它的转录因子在细胞周期的G1/S期调控细胞的增殖。最近有研究发现，RASSF1A通过抑制APCCdc20调控CyclinD1稳定性和有丝分裂的时机而发挥抑癌作用。多结构域的骨架蛋白CNKI参与Ras介导的细胞增殖信号途径，同时CNKI直接与RASSF1A结合，构成MST1/MST2激酶的伴侣分子参与活化Ras介导的促凋亡信号途径。
3 基因甲基化与肿瘤的关系
肿瘤的发生和发展是一个多阶段、多基因改变参与的渐进过程。多个癌基因的异常激活，编码蛋白过度表达，以及抑癌基因的缺失、突变失活导致细胞增殖失控而恶性转化，可能是肿瘤发生的分子基础。重要基因如抑癌基因的高甲基化导致基因功能的下降甚至丧失是肿瘤发病的重要原因之一。肿瘤细胞中含有CpG残基的片段甲基化更明显。这种甲基化过程可促使肿瘤细胞选择性地增生。在人类基因组，DNA甲基化是非常多见的，尤其在CpG岛胞嘧啶上，大约70％的CpG岛胞嘧啶发生甲基化[5]。DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化,DNA甲基化是一种基因外修饰,不改变DNA的一级结构,它在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用。DNA的甲基化可以改变染色体的结构从而引起不同的DNA结合蛋白的结合，启动子CpG岛的甲基化可引起甲基化CpG结合蛋白（MBDs）和转录抑制物组蛋白己酰化酶（HDACs）等结合到CpG岛，从而导致基因表达的缺失。抑癌基因正是通过CpG岛邻近启动子DNA甲基化而失活的。在肿瘤发生中,DNA异常甲基化表现为遗传和表遗传两种效应。遗传效应通过甲基化胞嘧啶的自发性脱氨和增加外来致癌物的亲和力等方式起作用,引起基因突变频率增加，而通过DNA CpG岛的甲基化使某些重要基因失去功能是肿瘤发病中的一个重要因素。肿瘤形成最基本的遗传性模式是原癌基因过度扩增与抑癌基因的 “沉寂”，细胞增殖平衡受到破坏而导致细胞的恶性状态，而原癌基因的扩增与其低甲基化有关，抑癌基因的“沉寂”与其高甲基化有关[6]。抑癌基因的异常甲基化在癌形成中起着持续的潜在作用，这种情况与基因缺失或畸变不同。临床的治疗策略是在转录这个过程，使其恢复正常。最近，MARIA等报道1例利用甲基化过程关闭Apaf1基因（正常情况下该基因会导致细胞凋亡）的转移性黑色素瘤。当该基因关闭时，肿瘤细胞对化疗不起反应而存活下来并发生转移。杂氮苷化合物可使DNA去甲基化，从而为黑色素瘤的治疗开辟一条新的途径。如果肿瘤的真正起源是由基因渐进性的改变所致，那么治疗方法就会变得明确。
4 RASSF1A甲基化与乳癌的关系
乳癌是世界上最常见的女性恶性肿瘤，全球每年约有150万妇女患乳癌，40万死于乳癌。近20年来，上海市女性居民乳癌发病率上升了2.55倍，已成为上海市女性第一位恶性肿瘤。肿瘤的发生涉及到癌基因的激活，抑癌基因的失活，凋亡抑制及细胞周期失调等多种因素的变化，这种调控网络的失衡，是多种基因及其产物相互作用的结果。其中，抑癌基因的高甲基化是乳癌发生发展的重要因素。
研究结果证实，RASSF1A在正常组织中100％表达，但在肺癌、乳癌、鼻咽癌和膀胱癌等肿瘤中却出现了较高频率的表达缺失，经甲基化特异性PCR检测发现其RASSF1A的启动子的CpG岛被高甲基化，却较少出现突变[7]。因此，目前认为，由于RASSF1A启动子的异常甲基化，引起了RASSF1A表达的缺失，导致了肿瘤的发生。研究发现，RASSF1A、APC等基因启动子甲基化广泛存在于乳腺导管癌、浸润性乳癌的各个分级或分期中，通过对病人血浆DNA的特异性甲基化PCR的检测，可以早期发现侵袭前或早期乳癌[8]。KRASSEN STEIN等[9]的研究也显示，在所有乳腺肿瘤中均可发现一个或更多的基因甲基化，相反，在健康妇女的正常乳腺组织中，其DNA很少发生甲基化。在乳癌中，很多重要的抑癌基因发生启动子甲基化，而且在原位癌或早期乳癌病人的DNA中可以检测到抑癌基因启动子的甲基化。SAUTER采用甲基化特异性PCR方法检测５１例原发性乳癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛的异常甲基化情况，结果显示，47.1％（24/25）的乳癌组织存在RASSF1A启动子区CpG岛的高甲基化，而相应的癌旁正常组织或非乳癌病人的正常组织中无１例呈现高甲基化，癌组织与癌旁正常组织发生启动子区CpG岛高甲基化的概率存在显著差异。研究表明，在原发性乳癌中，RASSF1A频繁发生启动子区的高甲基化与乳癌病理进程密切相关。癌肿局部侵袭越明显、淋巴结转移越远、分期越晚，甲基化发生率越高。同时，在ⅠＢ期乳癌标本中检测到RASSF1A的高甲基化，推测RASSF1A高甲基化在乳癌发生中可能也是一个相对较早的遗传学事件。这也说明RASSF1A启动子甲基化是一种早期的恶性转化[10]。
5 展望
RASSF1A的功能和作用机制还需要更深入的研究，但作为一种新近发现的抑癌基因，其失活见于多种肿瘤中，且研究表明该基因的失活与其启动子的高甲基化密切相关。随着对RASSF1A研究的深入，RASSF1A甲基化可作为一个分子标志物，用于肿瘤的早期诊断和预后分析。其脱甲基化后再表达也为肿瘤治疗提供了新思路。RASSF1A基因将会有更广阔的应用前景。
【参考文献】
[1]DAMMANN R, LI C. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J]. Nat Genet, 2000,25(3):315319.
[2]SEIDEL C. Alterations of cancerrelated genes in soft tissue sarcomas: hypermethylation of RASSF1A is frequently detected in leiomyosarcoma and associated with poor prognosis in sarcoma[J]. Int J Cancer, 2005,114(3):442447.
[3]BELL A, ELLIS C A. A role for the RASSF1A tumor suppressor in the regulation of tubulin polymerization and genomic stability[J]. Cancer Res, 2004,64(12):42444250.
[4]MINNA J, SHIVAKUMAR L, WHITE M A, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation[J]. Mol Cell Biol, 2002,22(12):43094318.
[5]BESTOR T H. The DNA methyltransferases of mammals[J]. Hum Mol Genet, 2000,9(16):23952402.
[6]TANG M W. Intensive hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A in hepatitis B virusassociated hepatocellular carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2003,9(9):33763382.
[7]ZHONG S, YEO W, YANG G, et al. Hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A (RASSF1A), a putative tumor suppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers[J]. Cancer Res, 2001,61(7):31053109.
[8]LEWIS C M, CLER L R, BU D W, et al. Promoter hypermethylation in benign breast epithelium in relation to predicted breast cancer risk[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(1):166172.
[9]KRASSENSTEIN R, SAUTER E, DULAIMI E, et al. Detection of breast cancer in nipple aspirate fluid by CpG island hypermethylation[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(1 Pt 1):2832.
作者单位：同济大学附属第十人民医院甲状腺乳腺疾病外科，上海 200072