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【摘要】 目的 探讨5-氮杂胞苷对人乳腺癌细胞Bcap-37细胞增殖的抑制作用及作用机制。方法 在乳腺癌细胞株MCF-7和Bcap-37中，应用甲基化特异性PCR（MSP）进行RASSF1A基因甲基化检测。检测5-氮杂胞苷前后RASSF1A基因甲基化、非甲基化状态的改变和检测RASSF1A基因的mRNA表达。结果 人乳腺癌细胞株MCF-7和Bcap-37中RASSF1A基因启动子区高甲基化。5-氮杂胞苷作用4天后，对Bcap-37细胞的RASSF1A基因有去甲基化作用，且mRNA表达明显增强。结论 RASSF1A基因启动子区在乳腺癌细胞中发生异常甲基化；5-氮杂胞苷能较好地逆转Bcap-37细胞RASSF1A基因异常甲基化，诱导RASSF1A基因的表达。
【关键词】 乳腺癌细胞 RASSF1A基因 基因甲基化 5-氮杂胞苷 甲基化特异性PCR（MSP）
Effeect of 5-azacytidine for breast cell on RASSF1A methylation and its expression
WU Li-ming,LI Ge-yi,YANG Jian-ping,et al.Shenzhen Center for Disease Prevention and Control,Shenzhen 518020,China
【Abstract】 Objective Inhibitory effect of 5-azacytidine on the proliferation of human breast cancer cell line Bcap-37 and its mechanism was investigated.Methods Using cell line MCF-7 and Bcap-37,the status of methylation of RASSF1A(RAS association domain family1A)gene was investigated by methylation special PCR(MSP),The methylation and unmethylation status of RASSF1A were detected by MSPand RASSF1A mRNA expression was detected by RT-PCR.Results Hymethylation of RASSF1A promoter was investigated in human breast cancer cell line MCF-7 and Bcap-37.After treatment with 5-azacytidine(>5μmol/L),the demethylation of RASSF1A gene occurred and RASSF1A mRNA expression was incressed.Conclusion Hymethylation of RASSF1A promoter was found in human breast cancer.5-Azacytidine may effectively enhance RASSF1A gene demethylation and enhance the expression of RASSFIA mRNA.
【Key words】 breast cancer cell;RASSF1A Gene;Gene Methylation;5-Azacytidine;methylation special PCR
乳腺癌是由乳腺导管上皮发生的恶性肿瘤，是妇女的常见恶性肿瘤之一。乳腺癌的发生机制尚不清楚。RASSF1（RAS associated domain family gene 1,RAS相关结构域家族基因1）是一种与肿瘤相关的基因，定位于染色体3p21.3，编码一组RAS效应蛋白［1］。使用不同的剪接和启动子，RASSF1基因形成三个主要的转录因子，即RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C。RASSF1A在正常组织中广泛表达，但在肺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中却出现表达缺失［2］。我们应用5-氮杂胞苷对乳腺癌细胞Bcap-37进行处理，观察抑癌基因RASSF1A的甲基化状态、mRNA转录表达及细胞生物学特性的改变，以期进一步探讨乳腺癌的发生机制并寻找乳腺癌治疗的新方法。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞 人乳腺癌细胞系Bcap-37、MCF-7、人乳腺上皮细胞HBL-100由中科院上海细胞所提供。
1.2 试剂与仪器 5-氮杂胞苷（5-azacytidine)、亚硫酸氢钠、氢醌为Sigma公司产品，DNAzol Reagent为Invitrogen公司产品，Trizol为Gibcol公司产品，TaqDNA酶、MMV Reverse Transcription Kit为Permentas公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 人乳腺癌细胞株MCF-7和Bcap-37中RASSF1A基因甲基化检测方法（甲基化特异性PCR MSP） Bcap-37、MCF-7和HBL-100细胞按5×105/ml，接种于25ml培养瓶中，培养48h后，用1ml DNAzol Reagent,按试剂盒操作说明抽提DNA。取1～2μg溶于50μl水，加入5.5μl NaOH,37℃，10min，加入新鲜配制的10mmol/L氢酶30μl和520μl的3mol/L亚硫酸氢钠(pH 5.0)混合后，58℃，16h，以Wizard DNA clean-up system回收并纯化后，将修饰的DNA溶于20μl水［3］，检测RASSF1A启动子甲基化状态，甲基化扩增引物（M）：F 5′-gtg tta acgcgt tgc gta tc-3′，R：5′-aac ccc gcg aac taa aaa cga-3′，扩增产物长度为94bp;非甲基化扩增引物（U）：F 5′-ttt ggt tgg agt gtg tta atg tg-3′，R 5′-caa acc cca caa act aaa aac a-3′,扩增产物长度108bp；引物由上海生工生物公司合成。PCR反应体为25μl,包括磺化修饰后的DNA2.0μl,10×buffer 2.5μl,2.5mmol/L dNTP 2.0μl,25mmol/L Mgcl2 2.0μl。Tap酶1U，上下游引物各0.5μl(10pg)，去离子水补至25μl，PCR条件；95℃ 5min,94℃30s,53℃ 40s,72℃ 30s，进行40个循环，最后一个循环72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色后，紫外灯下观察结果。
1.3.2 5-氮杂胞苷对乳腺癌细胞株Bcap-37的抑制作用
1.3.2.1 5-氮杂胞苷对RASSF1A基因的去甲基化作用 Bcap-37,HBL-100细胞按5×105/ml,接种于25ml培养瓶中，过夜后，更换培养基，实验组加入不同浓度的5-氮杂胞苷，剂量组为1.0、5.0、10.0μmol/L，对照组为等量PBS，培养箱中培养24h后，弃去药液并重新更换含新鲜药液的培养液，浓度同前，作用2天后弃去药液，更换含新鲜培养液的药液，4天后，用1ml DNAzol Reagnet,按试剂盒操作说明抽提DNA。MSP方法同1.3.1。
1.3.2.2 5-氮杂胞苷对RASSF1A基因的mRNA表达的影响 Bcap-37、HBL-100细胞的处理方法同1.3.2.1，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。取1μg总RNA进行cDNA合成，取随机引物1μl,5×buffer 4μl,Rnasin 20U,10mmol/L dNTP 2μl,Revertaid M-Mu1V Reverse Transcriptase(20U/ul)1μl,DEPT处理水至20μl，25℃10min,42℃ 60min,70℃ 10min进行逆转录。RASSF1A的引物序列：F：5′-tgg gag aca cct gac ctt tc-3′，R:5′-tgg gca ggt aaa agg aag tg-3′，扩增产物长度为249bp;GAPDH的引物序列：F：5′-gaa ggt gaa ggt cgg agt ca-3′，R：5′-gaa gat ggt gat ggg att tc-3′,扩增产物长度为226bp,GAPDH作为外参对照；PCR反应体为20μl，包括cDNA 2.0μl,10×buffer 2.0μl,25mmol/L MgCl2 1.2μl,2.5mmol/L dNTP 1.6μl,Tap酶1.25U，上下游引物各1.0μl，去离子水补至20μl，GAPDH作内参对照。PCR仪扩增条件：94℃5min,按94℃ 30s,57℃ 45s,72℃ 30s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色后，紫外灯下观察结果。
2 结果
2.1 人乳腺癌细胞株MCF-7和Bcap-37中RASSF1A基因甲基化检测方法 实验结果如图1。HBL-100细胞的4、5电泳道仅见非甲基化引物扩增出特异PCR条带；Bcap-37细胞的6、7电泳道仅见甲基化引物扩增出特异PCR条带，MCF-7细胞的8、9电泳道仅见甲基化引物扩增出特异PCR条带，表明MCF-7、Bcap-37细胞的RASSF1A基因的启动子区高甲基化。
1:DNA marker;2:M of H2O(-);3:U of H2O(-);4:M of HBL-100(-);5:U of HBL-100(+);6:M of Bcap-37(+);7:U of Bcap-37(-);8:M of MCF-7(+);9:U of MCF-7(-)
U：非甲基化引物；M：甲基化引物
图1 RASSF1A启动子甲基化检测结果
2.2 5-氮杂胞苷对RASSF1A基因的去甲基化作用 不同浓度5-氮杂胞苷（1.0、5.0、10.0μmol/L)处理4天的Bcap-37细胞和HBL-100细胞DNA分别扩增RASSF1A甲基化和非甲基化PCR产物，结果如图2。HBL-100细胞仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带；未经药物处理的细胞和1.0μmol/L 5-氮杂胞苷处理的Bcap-37细胞仅甲基化引物扩增出特异PCR条带，经5.0和10μmol/L 5-氮杂胞苷处理4天后，仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带，表明5-氮杂胞苷有去甲基化作用。U:非甲基化引物；M：甲基化引物
图2 RASSF1A启动子甲基化检测结果
2.3 5-氮杂胞苷对RASSF1A基因的mRNA表达的影响 如图3结果所示，HBL-100细胞有mRNA的表达，未经药物处理和经1.0μmol/L 5-氮杂胞苷处理的Bcap-37细胞无表达，经5.0和10.0μmol/L氮杂胞苷处理4天后的Bcap-37细胞的RASSF1A基因mRNA表达明显升高。表明5-氮杂胞苷能诱导RASSF1A基因沉默的再转录，诱导该基因的表达。1,14:DNA marker;2-6:GAPDH/Bcap-37;7:GAPDH/HBL-100 cell;8:RASSF1A/Bcap-37 with 0 μmol/L;9:RASSF1A/Bcap-37 with 1.0μmol/L;10:RASSF1A/Bcap-37 with ５.0 μmol/L;11:RASSFA/Bcap-37 with 10.0μmol/L;12:RASSF1A/H2O;13:RASSF1A/HBL-100 cell;
图3 RASSF1A mRNA表达检测结果
3 讨论
近年来分子生物学技术的发展，明显改变了人们对肿瘤发生机制的认识，控制基因表达而没有影响基因序列的表遗传机制越来越受到重视，DNA甲基化是表遗传修饰机制之一。甲基化模式随着细胞分裂稳定复制，而甲基化的异常易于被逆转，因而转变甲基化的异常模式，对抑制肿瘤细胞的增殖、诱发分化、提高肿瘤的治疗疗效等方面具有重要意义。
MSP方法简便、快速、灵敏性高，对DNA的质和量要求低，能用于微量的DNA的甲基化分析。RASSF1A启动子区有两个CpG岛，本试验用针对CpG岛2设计的特异引物进行MSP。MSP试验的关键是特异性引物的设计和亚硫酸氢钠处理DNA。
本研究选用5-氮杂胞苷作为去甲基化制剂处理人乳腺癌细胞，实验发现：Bcap-37细胞经不同浓度的5-氮杂胞苷处理后，仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带，且RASSF1A基因mRNA的表达也增强；说明5-氮杂胞苷对RASSF1A基因有较好的去甲基化，及mRNA重新表达。5-氮杂胞苷去甲基化功能可应用于临床肿瘤治疗，有报道在复发性和顽固性急性白血病和慢性髓性白血病危象时具明显疗效，在实体瘤作用尚不清楚。去甲基化制剂的研对肿瘤治疗提供了新的思路。
【参考文献】
1 Dammann R,Li C,Yoon JH,et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3Nat Genet,2000,25(3):315-319.
2 Burbee DG,Forgacs E,Minna JD,et al.Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancers and maliganant phenotype suppression.J Nat1 Cancer Inst,2001,93(9):691-699.
3 Herman GH,Jere MY,Graff JR,et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methlation status of CPG islands.Proc Nat1 Acad Sci USA,1996,93:9821-9826.
作者单位：518020 广东深圳，深圳市疾病预防控制中心