Rab27A在4种不同人乳癌细胞株中的表达

【摘要】  　　目的 检测Rab27A在4种人乳癌细胞中的定位、表达情况，初步研究Rab27A表达对乳癌细胞生物学特性的影响。方法 采用RTPCR技术，检测Rab27A mRNA在4种人乳癌细胞MCF7、MDAMB231、MDAMB435和MDAMB435HM中的表达并进行半定量分析。结果 Rab27A mRNA在人乳癌细胞MDAMB231、MDAMB435及MDAMB435HM中的表达水平分别是MCF7中的2.1、3.4和6.9倍，差异有显著意义(F=17.74～136.23，P<0.05、0.01)；Rab27A蛋白在人乳癌细胞MDAMB231、MDAMB435及MDAMB435HM中的表达分别是MCF7中的2.8、4.9和9.2倍，差异有显著性(F=37.74～154.29，P<0.05、 0.01)。 Rab27A蛋白弥散性分布于MCF7、MDAMB231和MDAMB435细胞浆中，MDAMB231和MDAMB435中又可见Rab27A蛋白在核周凝聚。结论 Rab27A表达可能与乳癌细胞侵袭转移能力有关。

【关键词】  乳腺肿瘤；Rab27A；肿瘤转移

　　EXPRESSIONS OF Rab27A IN FOUR KINDS OF HUMAN BREAST CANCER CELLS

　　XU PENG, LIU SONGLING, SUN GUOFENG, et al

　　(Department of Breast Surgery, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of Rab27A in four kinds of human breast cancer cells and its effect on cytobiologic characteristics of the cells.  MethodsThe mRNA of Rab27A was detected and semiquantitative analysis done by RTPCR in four kinds of breast cancer cells, i.e. MCF7, MDAMB231, MDAMB435,and MDAMB435HM. ResultsThe levels of Rab27A mRNA in MDAMB231, MDAMB435 and MDAMB435HM were 2.1, 3.4 and 6.9 times, respectively, that  in MCF7 (F=17.74-136.23;P<0.05,0.01). Rab27A protein expression in MDAMB231, MDAMB435 and MDAMB435HM was 2.8, 4.9 and 9.2 times that in MCF7, respectively (F=37.74-154.29;P<0.05,0.01). Rab27A was found to be targeted to diffuse in cytoplasm in three cancer cell lines and particularly concentrated in perinuclear in MDAMB231 and MDAMB435 cells.ConclusionThe expression of Rab27A is probably related to cancer cell potential of invasion and metastasis.

    ［KEY WORDS］Breast neoplasms; Rab27A; Neoplasm metastasis
   
　　乳癌远处转移是临床上乳癌病人治疗失败和死亡的主要原因。已有研究表明，一些分子参与了乳癌的侵袭转移，Rab27A是其中之一。本文检测了Rab27A基因在人乳癌细胞中的表达及定位情况，以期进一步研究其对乳癌细胞生物学特性的影响,现将结果报告如下。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

    人乳癌细胞株MCF7、MDAMB231和MDAMB435购自ATCC（American Type Culture Collection），并按照ATCC建议的方法进行培养，其侵袭能力逐个加强；MDAMB435HM细胞株是上海肿瘤医院中心实验室侯意枫等[1]通过裸鼠体内连续筛选的办法，由MDAMB435细胞建立起来的具有肺高转移潜能的细胞株。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  细胞培养 

　　各种细胞均按照标准方法进行培养。传代时用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例传代。

　　1.2.2  Rab27A mRNA表达检测 

　　清洗裂解待测细胞后，分离提取RNA并以DEPC水调整RNA的浓度为1 g/L，置-70 ℃冰箱保存。逆转录管中加入样品RNA及引物、AMV逆转录酶等，逆转录合成cDNA,并进行聚合酶链式反应, 取10 μL的PCR反应产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统分析结果。

　　1.2.3  实时半定量RTPCR检测 

　　建立Rab27A基因实时半定量RTPCR反应体系，经热启动、变性、退火、延伸，共40个循环，至4 ℃结束。每次PCR反应均以双蒸水代替cDNA模板作为阴性对照。

　　1.2.4  Rab27A蛋白表达检测 

　　采用Western blot 法。以不同浓度的标准牛血清清蛋白为样本，用自动酶标仪测出各样本的吸光度（A）值，绘制标准曲线。按相同方法测出待测蛋白样本的吸光度值，根据标准曲线读出其蛋白浓度。

　　1.2.5  免疫荧光及激光共聚焦扫描成像 

　　将待测细胞进行蛋白裂解并提取细胞总蛋白，用120 g/L SDSPAGE凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，室温下封闭后，经一抗杂交，TBST洗膜，二抗杂交后，混合ECL试剂并根据其试剂盒说明，于暗室中进行显影。用Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜间隔0.1 μm或0.2 μm扫描成像。

　　1.3  统计学处理

    应用SPSS 11.0软件进行数据处理，数据间比较采用χ2检验和方差分析。

　　2  结果

　　2.1  人乳癌细胞中Rab27A mRNA的表达

    Rab27A mRNA在4种人乳癌细胞MCF7、MDAMB231、MDAMB435和MDAMB435HM中的表达水平，随细胞侵袭转移能力的增强而升高；实时半定量RTPCR的检测结果显示，MDAMB231、MDAMB435和MDAMB435HM细胞中Rab27A mRNA的表达水平分别是MCF7细胞中的2.1、3.4和6.9倍，差异有显著性（F=17.74～136.23，P<0.05、 0.01）。 Rab27A蛋白在4种乳癌细胞中表达水平变化趋势与Rab27A mRNA相似，其在MDAMB231、MDAMB435和MDAMB435HM中表达水平分别是MCF7中的2.8、4.9和9.2倍，差异有显著意义（F=37.74～154.29，P<0.05、 0.01）。见表1。表1  Rab27A mRNA及Rab27A蛋白在4种人乳癌细胞中的表达（略）

　　2.2  Rab27A蛋白在乳癌细胞中的定位及与细胞骨架的关系

    在本文3种人乳癌细胞MCF7、MDAMB231和MDAMB435中，均可见到细胞浆中弥散分布的Rab27A蛋白；MDAMB231和MDAMB435细胞中，还可见到Rab27A蛋白在细胞核周围集中性分布。但未发现Rab27A蛋白定位与3种乳癌细胞骨架有明显的相关性。

　　3  讨 论

    乳癌发病率在西方国家始终居于女性恶性肿瘤的首位，在我国，发病率也呈逐年增高趋势。现在已有研究表明，一些分子如细胞黏附分子、癌基因抑癌基因、细胞外基质降解酶类和血管生成因子等参与乳癌的侵袭转移过程。Rab蛋白是Ras相关的小GTP酶超家族的成员，有特定的亚细胞定位，在细胞的分泌、胞吞、信号转导和发育等过程中发挥重要的作用[2],可能参与乳癌的侵袭转移。本实验检测了Rab27A在具有不同侵袭转移能力的乳癌细胞中的表达情况，结果显示，随着乳癌细胞侵袭转移能力的增强，Rab27A mRNA的表达水平也明显增高，半定量RTPCR和Western blot结果也显示Rab27A mRNA和Rab27A蛋白水平也随着乳癌细胞侵袭转移能力增强而提高，这些结果均提示Rab27A的表达可能与乳癌细胞侵袭转移能力有关，可能参与乳癌细胞侵袭转移表型的获得。
   
　　在真核细胞中，细胞的生长发育、生物合成、信号转导、分泌等重要生物过程都伴随着蛋白质在各细胞器之间的运输，蛋白质在细胞内的运输有赖于囊泡运输来完成，Rab蛋白家族就是囊泡运输重要的参与和调节因子。Rab27A基因定位于人15q1521.1，其编码蛋白主要参与细胞内特定分子的运输[3]。人类Rab27A基因的功能缺失性突变导致了格里塞利综合征（GS），GS是一种罕见的表现为部分性白化病和严重免疫缺陷的常染色体隐性遗传病，其分子机制研究显示上述症状的产生是由于Rab27A基因突变导致黑色素颗粒的运输和CTL中分泌颗粒的释放障碍[4,5]。Rab27A还广泛表达在转化的分泌细胞中，如外分泌细胞（特别是分泌黏蛋白和酶原的细胞）、内分泌细胞等，而且这些细胞中的大部分都有调节性胞吐作用[6]。最近的研究还显示，Rab27A在胰岛素和嗜铬颗粒的运输和释放中都起一定的作用[7,8]。乳癌细胞的自分泌和旁分泌功能已有报道[9],而且在乳癌的发生、发展中起重要的作用，因此Rab27A也有可能参与乳癌的某些分泌功能从而影响其表型。本实验通过免疫荧光和激光共聚焦扫描成像也显示，Rab27A在乳癌细胞中主要弥散分布于胞浆，在MDAMB231和MDAMB435细胞中，又集中定位于胞浆中核周围，这与Rab蛋白参与囊泡形成是相符的。

【参考文献】
  　　[1]LIID Q, WANG L, FEI F, et al. Identification of breast cancer metastasisassociated proteins in an isogenic tumor metastasis model using twodimensional gel electrophoresis and liquid chromatographyion trapmass spectrometry[J]. Proteomics, 2006,6:33523368．

　　[2]SEABRA MC, MULES E H. Rab GTPases, intracellular traffic and disease[J]. Trends Mol Med, 2002,8:2330.

作者单位：1 青岛大学医学院附属医院乳腺病治疗中心，山东 青岛 266021； 2 青岛市肿瘤医院外一科； 3 青岛市肿瘤医院肿瘤内科； 4 复旦大学肿瘤医院乳腺外科