点击显示 收起
【摘要】 ［摘要］ 目的 探讨刺参黏多糖（Sjamp）对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。方法 以0～1.6 g/L Sjamp分别处理HeLa细胞72 h后，以Fluo23／AM检测宫颈癌HeLa细胞内钙离子浓度的变化，并应用流式细胞仪观察Sjamp对人HeLa细胞凋亡率的影响。结果 Sjamp作用后的人HeLa细胞凋亡率升高且与药物剂量呈依赖关系（F=505.71, P<0.05)；Sjamp作用后的人HeLa细胞内钙离子浓度升高且与药物剂量呈依赖关系(F=247.46,P<0.05）。结论 Sjamp能剂量依赖性地诱导HeLa细胞凋亡，而细胞内钙离子浓度增高可能是其诱导凋亡的机制之一。
【关键词】 刺参黏多糖 HeLa细胞 细胞凋亡
EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS SEKENKA ON APOTOSIS OF HeLa CELLS OF HUMAN CERVICAL CARCINOMA
CHEN LING, YU ZHUANG, SONG YANG, et al
(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;
［ABSTRACT］ Objective To study the effect of stichopus japonicus sekenka (Sjamp) on apoptosis of HeLa cells in human cervical cancer. Methods HeLa cells were treated by various concentrations of Sjamp from 0 g/L to 1.6 g/L,the effect on apoptosis was observed by flow cytometry. Calcium in cells was detected by Fluo²3/AM. Results After acting by Sjamp, the apoptosis rate of HeLa cells rose (F=505.71,P<0.05), the concentration of intracellular Ca2+ increased, both became dose²dependent (F=247.46,P<0.05). Conclusion Sjamp can induce the apoptosis of HeLa cells dose²dependently, the increase of intracellular Ca2+ maybe one of the mechanisms leading to apoptosis.
［KEY WORDS］ Stichopus japonicus sekenka; HeLa cells; Apoptosis
宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳癌居第二位，而且近年来有年轻化的趋势[1],寻找有效的抗癌制剂以提高宫颈癌的治愈率成为宫颈癌研究的当务之急。刺参黏多糖（Sjamp）为自海洋腔肠类动物刺参体内提取的一类多糖类物质,初步研究结果证实,Sjamp具有广谱抗肿瘤活性，能有效抑制多种恶性肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡[2]。本研究旨在观察Sjamp对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞来源
人宫颈癌HeLa细胞为本实验室传代保存，培养于37 ℃、体积分数为0.05的CO2湿化孵箱中，培养基为含有体积分数0.10胎牛血清（FBS）的DMEM，取其对数生长期细胞待用。
1.2 仪器与试剂
Sjamp制剂由中国海洋大学药物研究所提供；DMEM及胰蛋白酶为GIBCO公司产品； FBS为杭州四季青公司产品； Fluo²3／AM、F127以及Annexin V²FITC／PI试剂盒为美国Sigma公司产品；流式细胞仪由美国Beckman Coulter公司生产。
1.3 方法
1.3.1 Annexin V²FITC／PI染色法检测HeLa细胞的凋亡 将HeLa细胞接种于6孔板，调整每孔细胞数为0.9×105/L，培养24 h，分组加药，以不加药组为对照组。取不同浓度Sjamp溶液（0、0.8、1.2、1.6 g/L）2 mL（每组设6个复孔），分别作用于人宫颈癌HeLa细胞72 h后直接收集到10 mL的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。用PBS洗涤3次，1 300 r/min离心5 min。用200 μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min。加入荧光溶液PI 10 μL，FITC 5 μL，4 ℃下孵育20 min，避光并不时振动。流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长为488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长为560 nm的滤器检测PI。
1.3.2 细胞内钙离子浓度测定 在6孔板中，每孔加入1×107/L的HeLa细胞悬液1.5 mL，待细胞齐鲁医学杂志2009年4月第24卷第2期 Med J Qilu, April 2009, Vol.24, No.2贴壁,以不同浓度Sjamp（0、0.8、1.2、1.6 g/L）2 mL作用HeLa细胞72 h，制备成0.25 mL单细胞悬液。将等量的水溶性AM酯(终浓度为5 μmol/L)和细胞悬液充分混合，37 ℃下充分孵育30 min。用PBS冲洗细胞2次，用流式细胞仪以Fluo²3/AM为荧光指示剂检测细胞内钙离子浓度的改变。
1.4 统计学处理
所有数据均采用SPSS 11.5及PPMS 1.5[3]软件包进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间数据比较采用方差分析，两组间比较采用q检验。
2 结果
2.1 Sjamp作用后细胞凋亡率的变化
与对照组比较，随着Sjamp浓度的增加，HeLa细胞凋亡率逐渐升高，呈浓度依赖性(F=505.71,q =8.35～46.78，P<0.05)。见表1。
2.2 细胞内钙离子浓度的变化
Fluo²3/AM染色及流式细胞仪检测结果表明，用不同浓度的Sjamp处理HeLa细胞72 h后的荧光强度不同。随着Sjamp浓度的增加，荧光强度逐渐升高，呈浓度依赖性(F=247.46，q=22.35～75.55，P<0.05)。见表1。
表1 不同浓度Sjamp对HeLa细胞凋亡率及荧光强度影响的比较（略）
3 讨论
Sjamp为海洋动物刺参体壁富含的一种多糖类活性物质，具有广谱的抗肿瘤活性，能抑制多种恶性肿瘤细胞增殖，诱发细胞凋亡，但其抗肿瘤的分子机制还处于研究阶段。通过3H²TdR 掺入的实验研究显示，Sjamp能够明显抑制S180 及鼠乳腺肿瘤细胞DNA 的合成，从而抑制肿瘤生长，而对荷瘤小鼠正常肝细胞的DNA 合成则具有明显促进，这有利于正常肝细胞的增殖。胡人杰等[4]对Sjamp与泼尼松联合应用对小鼠实体瘤的抑制作用进行了研究，结果表明，Sjamp不仅可以消除泼尼松所致的免疫抑制作用，而且对小鼠实体瘤、肺癌及胃纤维肉瘤有较好的抑制作用，抑瘤率为27%～82%。
细胞凋亡是指为了维持个体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡，它在生物进化、内环境稳定以及系统的发育中起着重要作用。钙离子浓度的升高参与了凋亡早期信号转导和凋亡的执行。细胞凋亡早期线粒体出现内膜渗透性改变，钙离子摄入增加，跨膜电位降低，细胞色素C和凋亡诱导因子释放等。MCCONKEY等[5]认为钙离子通过两条途径诱导细胞凋亡：一是胞内钙库释放，胞外钙离子内流促使胞浆钙离子持续升高，作为凋亡信号启动细胞凋亡；二是钙离子的释放打破了细胞结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。DANIAL等[6]认为线粒体膜表面分别存在着Bcl²2家族的Bax同型二聚体，非磷酸化的Bad将直接导致Bax的单聚化，从而形成线粒体的钙离子内流和细胞色素C外流的PTP交换通道，其结果是导致膜电位降低、ATP形成不足以及下游的Caspases活化[6,7]。本实验研究表明，Sjamp作用72 h后在体外观察到不同浓度Sjamp可促进HeLa细胞凋亡，随药物浓度升高，凋亡率升高，并且细胞内钙离子浓度明显升高。细胞内的钙离子浓度提高通常是一种生理信号，会引起许多重要的生理反应，巨大的钙离子浓度梯度也使细胞处于一种永恒的危险境地，易于受到许多因素的作用，从而影响钙信号调控作用，导致细胞功能异常，严重时可诱导细胞损伤[8]。
总之，根据本实验结果初步推论Sjamp抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖是通过诱导细胞凋亡来实现的，其机制可能与细胞内钙离子浓度的升高有关，具体机制尚有待于进一步研究。本研究对刺参黏多糖应用于临床的肿瘤包括宫颈癌的治疗提供了有价值的实验依据，刺参黏多糖可望成为具有良好应用前景的抗癌药物。
【参考文献】
[1]ZHAO E F, BAO L, LI C, et al. Changes in epidemiology and clinical charac2 teristics of cervical cancer over the past 50 years[J]. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 2005,25(6):6052609.
[２]TIAN F, ZHANG X, TONG Y, et al. PE,a new sulfated saponin from sea cucumber, exhibits anti 2 angiogenic and anti2tumor activities in vitro and in vivo [J]. Cancer Biol Ther, 2005,4 (8) : 8742882.
[4]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):91293.
[4]胡人杰,于苏萍,姜卉,等. 刺参酸性黏多糖与可的松联用方案对小鼠肿瘤的抑制作用[J]. 癌症, 1997,16(6):4222424.
[5]MCCONKEY D J, ORRENIUS S. The role of calcium in the regulation of apoptosis[J]. Leukc Biol, 1996,59：7752783.
[6]DANIAL N N, GRAMM C F, SCORRANO I, et al. BAD and glucokinase reside in a mitochondrial complex that integrates glycolysis and apoptosis[J]. Nature, 2003,424：9522956.
[7]王颖,于壮,宋扬. 刺参黏多糖对人宫颈癌HeLa细胞caspase表达影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(3)：1912194.
[8]EIGEL B N, GURSAHANI H, HADLEY R W. Na+／Ca2+ exchanger plays a key role in inducing apoptosis after hypoxia in cultured guinea pig ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004,287：146621475.
作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东 青岛 266003; 青岛大学医学院营养学教研室