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【摘要】 目的 通过检测顺铂在脑组织中的浓度变化，观察全脑常规分割外照射对血2脑脊液屏障通透性的影响。方法 将Wistar大鼠50只随机分为0、10、20、30、40 Gy组,每组10 只,用6 MV的X线加1.0 cm厚组织补偿进行全脑常规分割外照射,每次2 Gy,每天照射1次,每周照射5 d。各组大鼠完成既定照射总量后16 h经腹腔注射顺铂（1.0 mg/kg），20 min后采集静脉血及脑组织,采用高效液相色谱法测定血清和脑组织中顺铂的浓度。结果 各组大鼠血清中顺铂浓度比较差异无统计学意义（F=0.16,P>0.05）。大鼠脑组织中顺铂的浓度随照射剂量的增加而逐渐增高，各组间比较差异有显著性（F=63.12，q=2.231～18.005,P<0.05、0.01）。结论 放射治疗可增加血2脑脊液屏障通透性,全脑放疗20～30 Gy时为加用化疗的最佳时机。
【关键词】 颅脑照射 血脑屏障 顺铂 放射疗法 大鼠 Wistar
THE EFFECT OF WHOLE BRAIN IRRADIATION ON BLOOD²BRAIN BARRIER PERMEABILITY IN RATS
XUE XIU²YAN, AN YONG²HENG
(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of whole brain conventional fractionation irradiation on permeability of blood²brain barrier (BBB) in rat through measuring cisplatin concentration (DDP) in brain tissue. Methods Fifty adult Wistar rats were randomized to five groups based on different irradiation doses: 0 Gy; 10 Gy; 20 Gy; 30 Gy; and 40 Gy²groups. A 1.0 cm²thick tissue compensator was utilized, then all rats were exposed to conventional fractionation (2 Gy/d, 5 d/w) with 6 MV X ray. DDP (1.0 mg/kg) was injected into the abdominal cavity 16 hours after the irradiation. Brain tissue and blood were collected 20 minutes later. The samples were used to assay DDP concentration using HPLC. Results The average serum concentrations of DDP in different groups were not significantly different (F=0.16,P>0.05). While the average concentrations of DDP of brain tissues increased along with increase of the irradiation doses, the differences among the groups were significant (F=63.12;q=2.231-18.005;P<0.05,0.01). Conclusion Irradiation can increase the permeability of BBB. The whole brain irradiation ranges from 20 Gy to 30 Gy would be considered as the optimum for chemotherapy.
［KEY WORDS］ Cranial irradiation; Blood²brain barrier; Cisplatin; Radiotherapy; Rats, Wistar
放射治疗是目前颅内肿瘤的主要方法之一，但对多数颅内肿瘤的疗效较差，因此颅内肿瘤的放化疗联合治疗成为国内外研究的热点，尤其是同期放化疗，但是此方面的实验研究比较少。颅内肿瘤放疗或化疗的效果与血²脑脊液屏障的功能密切相关。由于血²脑脊液屏障的存在, 可限制物质在血液和脑脊液及血液与脑组织之间的自由交换,以维持脑组织周围稳定的化学环境，对人体大脑起到了很好的保护作用。但是也限制了药物的进入,致使抗癌药物无论是静脉注射还是动脉灌注, 都难以在脑组织中达到有效浓度,不能充分发挥疗效。研究发现,放射线能使血²脑脊液屏障功能下降,通透性增高。顺铂是临床上广泛应用的抗肿瘤药物，且其能进入脑肿瘤组织，可作为脑肿瘤放射治疗的增敏剂[2]。本文拟用动物实验进一步验证颅脑放射治疗对血²脑脊液屏障功能及顺铂通过血²脑脊液屏障的影响，以便为颅内肿瘤病人采用放疗联合含顺铂化疗方案治疗的顺序性及交叉接触最佳时间提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 仪器 Waters 2690泵、996PDA监测器、Millenium 32位色谱工作站。色谱柱:Waters Synmetry ODS 150 mm×3.9 mm，5 μm。漩涡混悬器，微量进样器。
1.1.2 试剂 注射用顺铂购于齐鲁制药厂，二乙基二硫代氨甲酸钠（DDTC）、氯化镍购于青岛欧瑞恩生物制剂有限公司。
1.1.3 实验动物 Wistar大鼠50只，体质量为170～260 g，平均200 g，购于青岛市药物研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱测试条件 流动相为水²甲醇（28∶72），流量1.0 mL/min，波长254 nm，柱温38 ℃。
1.2.2 动物分组 将50只Wistar大鼠随机分为5组，0（对照）、10、20、30、40 Gy 组，每组10 只。
1.2.3 照射方法[1] 大鼠均经水合氯醛麻醉后俯卧位固定于治疗床上，用6 MV的X线，加1.0 cm凡士林油纱布作为组织补偿，进行全脑常规分割外照射，各组的照射剂量分别为0、10、20、30、40 Gy。源皮距为75 cm,照射野约2.5 cm×2.5 cm，下界位于双耳后连线，上界及左右侧开放，垂直照射，每次2 Gy,每天照射1次,每周照射5 d。照射结束后同一条件下饲养。
1.2.4 给药方法与样品采集 完成既定照射总量后16 h每组大鼠均经腹腔注射顺铂1.0 mg/kg，20 min后取静脉血1 mL，然后立即断头取出脑组织。分别在1 mL血样中加入1倍量生理盐水，离心10 min（10 000 r/min），吸取上清液留做血清样品，置-20 ℃冰箱低温保存；同时将各组脑组织样本放入-70 ℃冰箱低温保存待测。
1.2.5 顺铂浓度测定 采用高效液相色谱法（HPLC）[2,3]。在已有的色谱条件下首先建立药物标准曲线，然后处理样品。 ①血清样品:在2 mL血样中加入1倍量生理盐水,离心 10 min（10 000 r/min）,吸取上清液。0.22 μm 膜滤过,取10 μL注入HPLC,按标准曲线法计算浓度。②脑组织:将脑组织用生理盐水洗去血迹,滤纸吸干,剥离脑膜血管,按脑组织∶生理盐水=1.0∶1.5(质量∶体积)的比例匀浆,离心10 min,取上清液。0.22 μm膜滤过,取 10 μL注入HPLC,按标准曲线法计算浓度。
1.3 统计学分析
采用SPSS 11.5和PPMS 1.51[4]统计软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析。
2 结果
10 Gy组和40 Gy组照射后期各死亡1只，其余大鼠均完成照射而未出现严重不良反应。各组大鼠血清中的顺铂浓度差异无统计学意义（F=0.16，P>0.05）。脑组织中顺铂浓度随照射剂量的增加而逐渐增高，各组间比较差异有显著性（F=63.12,q=2.231～18.005,P<0.05、0.01）。见表1。
3 讨论
颅内肿瘤的发病率呈上升趋势,合理的综合治疗对于提高颅内肿瘤治疗的有效率具有重要意义。近年进行的放化疗联合治疗颅内肿瘤，尤其是同期放化疗,较单纯放疗有效[5]，但血²脑脊液屏障是影响颅内肿瘤药物治疗效果的重要因素，开放血²脑脊液屏障并适时加用化疗药物成为治疗的重点及研究的热点。通过动物实验了解放化疗联合治疗的机制，对探讨临床最佳综合治疗方案有着重要价值。
表1 各组大鼠血清与脑组织中顺铂浓度比较（略）
与对照组比较，F=63.12，*q=4.392～18.005，P<0.01；与10 Gy组比较，#q=8.434～13.269，P<0.01；与20 Gy组比较，△q=4.057、5.179，P<0.05、0.01；与30 Gy组比较，※q=2.231，P<0.05
放射治疗是目前治疗颅内肿瘤的主要方法之一，DNA是放射线对细胞杀伤的靶部位，放射线对细胞的杀伤决定于DNA损伤的量和细胞对损伤的修复能力。放射线对DNA的损伤表现为DNA的单链断裂和双链断裂。放射损伤的修复形式表现为亚致死损伤修复和潜在致死损伤修复。放射治疗杀死肿瘤细胞的同时也开放血²脑脊液屏障。NORDAL等[6]在实验研究的基础上提出了放疗开放血²脑脊液屏障的机制模型，认为受照射后内皮细胞凋亡导致了早期的血²脑脊液屏障破环，内皮细胞更新不足或持续的内皮细胞死亡导致血管通透性进一步增加；毛细血管灌注减少、血管内皮生长因子和细胞间黏附分子²1的表达等进一步破环血²脑脊液屏障的完整性，最终导致轴突缺失和坏死。
顺铂是目前临床上广泛应用的一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，对多种肿瘤均有较好的疗效。其药理作用主要是由游离的顺铂以及与小分子物质结合的顺铂浓度所决定，而与蛋白结合的顺铂几乎没有药理活性，因此本实验采用HPLC检测不同剂量射线照射后大鼠血清和脑组织匀浆中游离顺铂浓度的变化，更能准确反映药效作用和临床意义。顺铂具有抗瘤谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用且无交叉耐药等特点，同放射线一样，其对细胞杀伤的靶部位是DNA。临床研究证明，顺铂还可作为增敏剂与放疗配合应用，其放射增敏作用主要通过干扰受损害细胞的修复而与放疗具有协同作用，从而增强放射线对细胞的杀伤作用。
虽然单纯放疗治疗某些颅内肿瘤可以取得较好的近期效果，但由于全脑的放疗剂量有限，脑的单次放射耐受剂量一般为50～60 Gy[7],达不到肿瘤的致死剂量，肿瘤得不到根治，因此放化疗联合治疗肿瘤有重要意义。近10年的临床研究证明，同期放化疗可提高多种肿瘤的局部控制率和生存率，是临床研究的热点。在过去的10多年间，有4篇文献分析研究了化疗加局部放疗在晚期头颈癌治疗中的效果，结果显示化疗与放疗同期(同时或交替)使用可明显提高病人生存期。目前所知同期放化疗主要的生物学机制为时相协同作用，即当两种治疗手段同时给予或在一个短的时间间隔后给予时，对所治疗的病变将起到联合作用。本实验结果显示, 在10～30 Gy放射剂量范围内脑组织中顺铂浓度随放射剂量的增加而逐渐升高，但在照射至20～30 Gy时浓度升高极为明显，40 Gy与30 Gy两组比较浓度差异无显著性,故在照射剂量达20～30 Gy时加用化疗，脑组织内的药物可达到较高的浓度，从而发挥最好的治疗效果 。
【参考文献】
[1]齐彩霞,安永恒. 全颅常规外照射对大鼠血2脑脊液屏障上P2gp和MRP1表达的影响及意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,4(2):992101.
[2]李杰,安鸿志,刘彩玉. 高效液相色谱法测定人血浆中顺铂的含量[J]. 中国药房, 2006,17(18):139921402.
[3]贾钰铭,丁正,林渝峰,等. 冰片促进顺铂透过血脑屏障的实验研究[J]. 四川医学, 2004,25(2):1562157.
[4]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):91293.
[5]曹志成. 颅内肿瘤综合治疗及其分子治疗研究进展[J]. 南方医科大学学报, 2007,27(7):104721051.
[6]NORDAL R A, WONG C S. Molecular targets in radiation induced blood2barrier disruption[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2005,62(1):2792287.
[7]MARANZANO E,TRIPPA F, PACCHIARINI D, et al. Re2irradiation of brain metastases and metastatic spinal cord compression: clinical practice suggestions[J]. Tumori, 2005,91(4):3252330.
作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003