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【摘要】 目的 探讨雌激素受体亚型、血管内皮生长因子（VEGF）的表达与子宫内膜异位症（EMs）的相关性及其预后的关系。方法 采用免疫组化法检测79例EMs病人异位内膜组织及20例正常子宫内膜标本中的雌激素受体亚型-α（ER-α）、雌激素受体亚型-β（ER-β）及VEGF的表达情况，并分析其与EMs预后的关系。结果 异位内膜组ER-α、ER-β阳性表达率及表达强度均低于正常子宫内膜组(χ2=9.98、4.23,P<0.01、0.05)，VEGF阳性表达率高于正常子宫内膜组(χ2=4.11,P<0.05)。异位内膜VEGF高表达的EMs病人复发率明显高于低表达者(χ2=6.39,P<0.05)； 异位内膜中ER-α高表达者VEGF表达率亦相应较高，ER-α低表达者其VEGF表达率亦相应较低（r=0.93，P<0.01）。结论 ER-α、ER-β可能参与了EMs发生发展的病理过程及异位内膜血管生成的调节,检测VEGF的表达对于估计EMs的预后可能有重要临床价值。
【关键词】 子宫内膜异位症 雌激素受体α 雌激素受体β 血管内皮生长因子A 免疫组织化学
子宫内膜异位症（EMs）是育龄妇女常见的良性病变，却具有类似恶性肿瘤种植、转移及复发等生物学恶性行为，而其高复发给临床治疗带来极大的困难和挑战。目前，临床上尚缺乏有效的EMs预后指标。近几年提出，EMs是一种依赖血管生成和对雌激素敏感的疾病［１］。雌激素只有与内膜上相应受体结合才能影响细胞代谢或对基因进行调控。而异位内膜在腹壁或卵巢生长以及腺肌症内膜在肌层的增生必须有新生血管生成以供给内膜细胞营养［１］，血管内皮生长因子(VEGF) 是强有力的血管活性因子，通过增加血管通透性，改变血管内皮细胞基因表达，促进血管内皮细胞有丝分裂等途径导致新生血管生成。本文应用免疫组化法检测雌激素受体亚型-α（ER-α）、雌激素受体亚型-β（ER-β）及VEGF在EMs病人病变组织的表达情况，以探讨其与EMs发生发展及预后的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
EMs病人79例，为青岛大学医学院附属医院妇科2004～2007年收治病人，年龄23～50岁，平均（36.5±2.1）岁。入选标准：①均行卵巢巧克力囊肿剥除术；②入院前未经手术及相关性激素药物治疗；③所有病人术后均给予孕三烯酮治疗3个月；④术后经病理学证实为卵巢巧克力囊肿；⑤按1985年美国生育协会修正分期标准（r-AFS分期）进行分期：Ⅲ期44例，Ⅳ期35 例；⑥术后随访12个月以上。复发15例，复发时间为术后6～34个月，平均13个月；复发年龄24～46岁，平均33岁；未复发64例。复发的诊断符合文献［2］标准。复发组与未复发组病人年龄无统计学差异。同时，选取同期子宫肌瘤手术病人的正常子宫内膜20例，病人年龄42～57 岁, 中位数年龄48.1岁,病人月经规律, 无内科并发症, 3个月内亦未用过相关性激素治疗。
1.2 检测指标及方法
标本均经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。采用PictureTM通用试剂二步法检测ER-α、ER-β及VEGF表达，操作严格按照试剂盒说明书进行。以微波枸橼酸盐进行抗原热修复。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。ER-α、ER-β蛋白染色阳性呈棕黄色，主要定位于细胞核；VEGF以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性判断标准。按照SHIMIZU等［3］的方法，以综合染色强度和阳性细胞百分率计分确定表达水平。①染色强度：无染色或染色不清为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；深棕色或褐色为3分。②阳性细胞百分率：阳性细胞数<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。每张切片计分等于以上二项分数的乘积，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（），>5分为强阳性（）。结果判断在双盲下进行,每张切片由两名病理科医生分别计数。因样本数小,为了统计方便, 将中度阳性表达与强阳性表达合并为高表达, 弱阳性表达与阴性表达合并为低表达。
1.3 统计学处理
应用SPSS 14.0及PPMS 1.5［4］统计学软件进行数据处理，数据间比较采用卡方检验和Pearson相关分析。
2 结 果
2.1 ER-α、ER-β与VEGF免疫组化染色
ER-α、ER-β蛋白主要表达于腺上皮细胞的细胞核，在两组内膜腺上皮细胞胞浆中亦有所表达，同时在间质和血管内皮细胞中也有所表达；VEGF主要表达于内膜细胞腺上皮的胞浆。
2.2 ER-α、ER-β与VEGF的表达
正常内膜组织ER-α、ER-β阳性表达率分别为85.00％和75.00％，异位内膜分别为45.57％和49.36％，正常内膜ER-α、ER-β的阳性表达率明显高于异位内膜，差异有统计学意义(χ2=9.98、4.23,P<0.01、0.05)。VEGF在正常内膜组织的阳性表达率为65.00%，异位内膜为84.81%，异位内膜组VEGF的阳性表达率高于正常内膜组, 差异亦有统计学意义(χ2=4.11,P<0.05)。见表1。
2.3 EMs病人ER-α、ER-β、VEGF的表达与预后的关系
VEGF高表达的EMs病人复发率明显高于低表达者(χ2=6.39,P<0.05)。ER-α高表达的EMs病人与低表达的EMs病人复发率相比，差异无显著性(χ2=2.59,P>0.05)。复发组ER-β的表达强度高于未复发组，但差异无显著性（χ2=1.85,P>0.05）。见表2。表1 正常内膜和异位内膜ER-α、ER-β与VEGF表达的比较表2 EMs病人ER-α、ER-β、VEGF表达与预后的关系
2.4 EMs病人ER-α、ER-β与VEGF表达之间的相关性
本文有28例异位内膜中ER-α与VEGF同时为高表达。EMs病人异位内膜中ER-α高表达者VEGF表达率亦相应较高，ER-α低表达者VEGF表达率亦相应较低（r=0.93,P<0.01）；而ER-β与VEGF的表达无相关性(r=0.25，P>0.05)。
3 讨 论
SHIMIZU等［3］研究结果表明，EMs是激素依赖性疾病，异位内膜的生长和侵袭依赖于性激素，而性激素只有与相应的受体结合后才能起作用，性激素受体水平的上调或下调与性激素及相关细胞因子有关［5］。长期以来，人们一直认为雌激素是通过单一的受体发挥作用，1996年GUSTSFSSON发现小鼠和人均存在另一个ER并命名为ER-β，二者的DNA与配体结合区有97%和60%的同源性，而在染色体位置、组织分布及其与激素类化合物亲和力的功能差异极大［6］，使人们认识到雌激素不仅仅单纯通过ER-α发挥作用,还有可能通过ER-β起作用［7］。检测EMs病人异位内膜上皮细胞中ER-α和ER-β的表达可能对深入研究EMs的发病机制有重要意义。本研究结果显示，异位内膜ER-α、ER-β的阳性表达率虽然均低于正常内膜，但是ER-β在异位内膜的表达率相对增高，说明异位内膜激素受体的改变可能影响了局部雌激素代谢，致使异位内膜呈现出不成熟生长而使异位灶持续增长，与HUDELIST等［8］通过免疫组化分析得出的异位子宫内膜组织中β-ER 表达增加而α-ER 表达减少结论一致。FUJIMOTO 等［9］检测亦显示，异位内膜中ER-β mRNA 表达增强,而ER-α表达较弱。提示由ER-α介导的雌激素作用可能被部分破坏，继而作用相对减弱；而ER-β的相对高表达可能相对增强了雌激素对受体的作用，与异位内膜病灶的激素依赖性和扩张可能存在一定的关系。而MATSUZAKI等〖10,11〗分别用RT-PCR和原位杂交检测33例腹膜EMs和37例卵巢EMs的ER-α、ER-β的mRNA, 认为ER-α在腺上皮和间质细胞的优势表达是腹膜和卵巢EMs发生发展的基础；长期使用GnRH-α诱导低雌激素状态,可明显降低异位内膜中ER-α表达，认为雌激素对在位和异位内膜的调节作用主要通过ER-α完成。提示ER-α、ER-β参与了EMs发生发展的病理过程。预后方面，HARRIS等［12］在切除和保留卵巢裸鼠的腹腔内注入人的正常子宫内膜碎片,建立了EMs模型,用ER-β激动剂ERB2041治疗15～17 d,可使病灶消退40%～75%,这种现象在卵巢保留和切除的裸鼠模型效果一样，从而认为使EMs复发的是ER-α而不是ER-β。而本文结果显示，异位内膜中ER-α高表达与低表达的病人复发率差异无显著性，复发组ER-β的表达强度较未复发组有所增强，但差异无显著性。推测ER-α与ER-β可能参与了EMs的复发。但由于本研究样本量较少，因此ER-α、ER-β与EMs复发的关系尚需要扩大样本进一步研究。
血管生成是EMs病变发生发展的重要环节。VEGF是公认的最为关键的血管生成因子。子宫内膜组织VEGF的表达情况可能对异位内膜的成功种植和发展有重要作用。GRUMMER 等［13］在裸鼠EMs模型中注射VEGF，发现其可促进EMs病灶发生，而注射VEGF抗体则可阻止种植灶的形成，表明EMs的发生发展有赖于血管的发生。FASCIANI［14］等研究显示，卵巢巧克力囊肿中VEGF浓度高于正常对照组,并且囊肿直径越大,VEGF浓度越低,说明血管生成是卵巢巧克力囊肿发展和维持的重要因素。本文结果也显示，正常内膜及异位内膜中VEGF的阳性表达率差异有显著性；异位内膜VEGF高表达的病人预后亦较差，提示VEGF促进新生血管生成可能不仅参与EMs发生的病理过程,而且在EMs临床进展过程中也可能发挥了重要的作用。一方面，VEGF可促进新生血管生成，有利于异位内膜种植和存活；另一方面，异位内膜的生长可以表达更多VEGF。说明VEGF等血管生成促进因子不但通过腹腔和组织局部旁分泌途径发挥作用, 也可通过内分泌途径刺激机体内的异位内膜生成新生血管,为异位生长的腺上皮细胞提供赖以生存的物质基础，促进异位内膜细胞增殖并加速其生长。因此, VEGF高表达的异位内膜生长更迅速,侵袭性更强,手术虽然切除了病灶,但在局部微环境高水平生长因素如VEGF调节下,残存的子宫内膜细胞可在其种植部位继续存活而致EMs复发。
EMs是一种依赖血管生成和雌激素敏感的疾病［１］。体内和体外的实验均表明，雌激素可能主要通过使VEGF mRNA表达水平上调,从而促进VEGF分泌而实现的［15］,且这种作用依赖ER的存在。HYDER等［16］研究显示，在VEGF基因上有与ER基因上雌激素反应元件高度同源的两个核苷酸序列,分别位于VEGF基因的5′和3′非翻译区,这两个序列均可以和ER-α或ER-β特异结合。雌激素通过ER-α或ER-β影响VEGF的表达。本实验结果显示，在异位内膜的血管内皮细胞中也有ER-α及ER-β的表达，ER-α高表达者其VEGF表达率亦相应较高；而ER-β与VEGF表达却无此趋势。表明雌激素及其受体亚型与血管生成相关，可能参与了异位内膜血管生成的调节，与郭志荣等［１］研究结果基本一致。其具体机制尚需进一步研究。然而有研究报道, 雌激素对VEGF表达的调节是从转录水平通过经典雌激素受体途径进行,通过增加VEGF mRNA的合成和延长mRNA半衰期可增加VEGF的表达。
EMs的预后受许多因素的影响，例如病人的年龄、用药方案、AFS分期及手术方式等。为排除这些因素对实验结果造成的影响,本实验所选研究对象均为行保守性手术、术前无用药史、术后应用常规剂量孕三烯酮治疗，且均为EMs Ⅲ期或Ⅳ期病人。
综上所述，EMs作为一种雌激素依赖性疾病，其发生与雌激素受体亚型密切相关，受体基因结构、功能及表达的异常对EMs发生发展和预后的研究有重要意义；同时，EMs的发生发展有赖于血管的发生，VEGF在新生血管生成、EMs发生发展中有重要作用。因此，研究VEGF、雌激素受体亚型在EMs发病中的作用以及对于EMs预后的意义,为寻找EMs的诊断标志物、抗血管生成治疗及评估预后提供了新的资料和思路。本文研究样本数较小，尚有待于进一步大样本的研究。
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作者单位：青岛大学医学院附属医院妇产科,山东 青岛 266003