替米沙坦和罗格列酮对糖尿病大鼠早期动脉粥样硬化形成影响

【摘要】  　　目的 观察血管紧张素Ⅱ1 型受体（AT1R）拮抗剂替米沙坦（TM）和噻唑烷二酮类（TDZs）药物罗格列酮（RSG）对2型糖尿病（T2DM）大鼠早期动脉粥样硬化形成的影响, 并探讨其可能的机制。方法 40 只雄性SD大鼠随机分为正常对照(NC)组、T2DM组、TM组和RSG组，每组10只。以喂高糖高脂饮食方法建立SD大鼠T2DM模型。T2DM组、TM组、RSG组给予高糖高脂饮食1个月后腹腔注射25 mg/kg链脲佐菌素；NC组给予普通饮食，注射枸橼酸缓冲液作为对照。在此基础之上，TM组给予替米沙坦5 mg/（kg·d）、RSG组给予马来酸罗格列酮5 mg/（kg·d）灌胃喂养，早晚各灌1次；NC、T2DM两组给予生理盐水灌胃。16周后测定各组大鼠总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平与稳态血糖（BG）、稳态胰岛素（PGI）浓度;用免疫组化法检测主动脉血管壁过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)及血管细胞黏附分子1（VCAM1）、细胞黏附分子1（ICAM1）表达水平。结果 T2DM组、TM组和RSG组TC、TG、LDLC与BG水平较NC组显著升高(F=17.67～205.32，q=3.61～35.07,P<0.05)，TM组和RSG组的TC、TG、LDLC与BG水平较T2DM组低，差异有显著性(q=4.58～17.03,P<0.01)。TM组和RSG组及T2DM组PPARγ表达水平明显高于NC组，但TM组和RSG组与T2DM组间无显著差异(P>0.05)；TM组、RSG组VCAM1、ICAM1表达水平明显低于T2DM组(F=27.35～311.66，q=19.42～22.80,P<0.01), 而各检测指标在两药物组中的表达差异无显著性（P>0.05），T2DM组和RSG组主动脉内皮损伤轻于T2DM组。结论 替米沙坦和罗格列酮能增强血管壁PPARγ活化，抑制VCAM1、ICAM1表达和单核细胞浸润,防止早期AS形成。

【关键词】  糖尿病，2型　动脉硬化　替米沙坦　罗格列酮

　　EFFECTS OF TELMISARTAN AND ROSIGLITAZONE ON EARLY ATHEROGENESIS IN RAT WITH DIABETES MELLITUS 

　　LI SHAN, CHEN ZUOYUAN, GAO WEI

　　(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To observe the effects of telmisartan (TM) and rosiglitazone (RSG) on early atherogenesis in male rats with type 2 diabetes mellitus (DM) and explore the mechanism. Methods Forty male SD rats were equally randomized to four groups: normal control (NC) group, type 2 DM group, TM group and RSG group. A rat model of DM was created by feeding high glucose and high fat diet. The rats in DM, TM and RSG groups were fed with high fat and high glucose diet for one month, then streptozotocin (25 mg/kg) intraperitoneally, to those in NC group, full diet was offered and citrate buffer injected, then followed by telmisartan 5 mg/（kg·d） for the TM, rosiglitazone 5 mg/（kg·d） for the RSG, and normal saline for the NC, which were given through intragastric asministration. The levels of TC, TG, LDLC, BG and PGI detected in all the groups 16 weeks later. Immunohistochemistry was used to analyze the expressions of PPARγ, VCAM1 and ICAM1 in the aorta vessel wall. Results Compared with the NC, the levels of TC, TG, LDLC and BG in the DM, TM and RSG groups increased significantly(F=17.67-205.32;q=3.61-35.07;P<0.01). The levels of TC, TG, LDLC and BG in TM and RSG groups were lower than that in DM group (q=4.58-17.03,P<0.01). The expressions of PPARγ in DM, TM and RSG groups was manifestly higher than that in the NC group, the difference was significant, but the differences within TM, RSG and  DM groups were not significant (P>0.05). The expressions of VCAM1 and ICAM1 in TM and RSG groups were lower than that in DM group (F=27.35-311.66;q=19.42-22.80;P<0.01).  The endothelial damage of the aorta in TM and RSG groups was less severe than that in DM group.  Conclusion Telmisartan and rosiglitazone can activate PPARγ and inhibit expressions of VCAM1, ICAM1 and infiltration of monocyte, and thus preventing early atherogenesis.
   
　　［KEY WORDS］ diabetes mellitus,type 2; atherosclerosis; telmisartan; rosiglitazone
   
　　2型糖尿病（T2DM）大血管病变的基本病理变化是动脉粥样硬化（AS）,而内皮细胞是糖尿病血管病变的关键靶组织，2型糖尿病伴有内皮功能异常，参与糖尿病大血管并发症的发生发展[1]。因此，对T2DM早期AS的防治就成了目前面临的重要任务。本研究选用AS 形成过程和病理特征与人很相似的大鼠作模型，观察T2DM大鼠早期AS形成时，血管壁过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和血管细胞黏附分子1（VCAM1）、细胞黏附分子1（ICAM1）的活化和表达及内皮下浸润单核细胞数的变化,探讨血管紧张素Ⅱ1 型受体（AT1R）拮抗剂替米沙坦（TM）和噻唑烷二酮类（TDZs）药物罗格列酮（RSG）对T2DM大鼠早期AS形成的影响, 并讨论其可能的机制，为T2DM早期AS的防治提供理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物和试剂
   
　　健康雄性清洁级SD大鼠40只，由青岛大学医学院实验动物中心提供，8周龄，体质量为180～220 g。标准化饲养房笼子喂养，每笼4只，自由进食饮水，每天光照12 h。
   
　　胆固醇、胆酸钠、链脲佐菌素（STZ）购自祁东同信生化厂，无水乙醚购自青岛大学医学院附属医院，抗PPARγ多克隆抗体试剂盒购自SANTA CRUZ公司（产品编号sc7273），EliVision试剂盒购于福州迈新生物科技有限公司，VCAM1及ICAM1多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。马来酸罗格列酮由天津葛兰素史克有限公司提供，替米沙坦由德国勃林格殷格翰公司提供。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  动物分组及AS模型制作 

　　将大鼠随机分为正常对照（NC）组、T2DM组、TM组和RSG组，每组10只。除NC组外，其他各组均以高糖高脂饮食制作糖尿病大鼠AS模型[2]：喂食高糖高脂饲料（每100 g饲料含猪油10 g，蔗糖20 g，胆固醇2.5 g，胆酸钠1 g，常规饲料66.5 g），饮用120 g/L的果糖水。1个月后空腹24 h后一次性单剂量腹腔内注射STZ(以pH 4.2的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制)25 mg/kg，NC组给予普通饮食，注射枸橼酸缓冲液作对照。TM组给予替米沙坦5 mg/（kg·d）、RSG组给予马来酸罗格列酮5 mg/（kg·d）灌胃喂养，早晚各灌1次，NC、T2DM两组给予生理盐水灌胃作为对照。所有大鼠均分笼按清洁级动物饲养，实验周期为16周。

　　1.2.2  血脂、血糖、胰岛素检测 

　　实验结束时经左心取空腹血标本,离心（3 000 r/min）10 min，在全自动生化分析仪上测定各组稳态血糖（BG）、稳态胰岛素（PGI）浓度与总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平。BG测定采用葡萄糖氧化酶法，血浆PGI测定采用CIS放免(竞争法)试剂盒(法国)。

　　1.2.3  病理形态学检查 

　　大鼠用10 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，左胸切口，经左心室用8.5 g/L氯化钠灌洗，至损伤的右心耳流出液清亮为止。立即取胸主动脉剪取同一部位约0.5 cm 长血管段固定于100 g/L缓冲甲醛液过夜，石蜡包埋，横断面连续切片，厚4 μm，分别用作苏木精伊红染色，观察病理形态学改变。

　　1.2.4  PPARγ、VCAM1、ICAM1表达检测 

　　实验结束后用戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠, 取病变部位血管等距切分4～5段，100 g/L中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋。血管标本横截面连续切片，厚度4 μm, 间隔100 μm再次切片，共切3个层面。用PS法分别进行PPARγ、VCAM1、ICAM1各指标的免疫组化染色，DAB显色，苏木精复染，显微镜下观察结果。PPARγ抗体以血管内皮细胞核内出现棕黄色颗粒物质为阳性，VCAM1、ICAM1以细胞膜和细胞质黄染为阳性。计数高倍镜下同一切片内全部阳性细胞及内皮细胞数，以阳性细胞占内皮细胞百分比表示PPARγ与VCAM1、ICAM1的阳性率。

　　1.3  统计学处理
   
　　使用SPSS 11.0及PPMS 1.5[3]统计学软件进行数据处理，所有数据均以±s表示，多组数据比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

　　2  结果

　　2.1  各组血糖、胰岛素、血脂检测结果比较
   
　　T2DM组、TM组和RSG组的血清TC、TG、LDLC、BG水平较NC组均显著升高（F=17.67～205.32，q=3.61～35.07,P<0.05），而PGI水平无明显差异（P>0.05）；TM组和RSG组血清TC、TG、LDLC、BG水平较T2DM组降低，且有显著差异（q=4.58～17.30，P<0.01）。见表1。表1  各组血清指标检测结果比较（略)

　　2.2  组织形态学改变
   
　　肉眼观察，NC组大鼠主动脉血管内膜光滑； T2DM组大鼠主动脉管壁可见有少量黄色脂样斑块向管腔凸出，主要分布于近主动脉弓处，呈片状分布，为局灶性。镜下观察，NC组内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中膜厚度均一，主要为收缩型平滑肌细胞；T2DM组内皮细胞体积增大，部分脱落，连接间隙增大，内皮表面黏附较多单核细胞，内膜有很多单核细胞浸润，并可观察到巨噬细胞和脂肪空泡，胞质中线粒体肿胀，中膜可见合成型平滑肌细胞。TM组和RSG组病变与T2DM组相似，但程度较轻，内膜较完整平坦,内皮黏附及浸润于内膜的单核细胞少于T2DM组，内膜增厚明显轻于T2DM组，但两组间无明显差别。齐鲁医学杂志2010年2月第25卷第1期  Med J Qilu, February 2010, Vol.25, No.1

　　2.3  各组免疫组化检测指标比较
   
　　T2DM组、TM组、RSG组与NC组PPARγ比较，差异有显著性（F=27.35， q=10.01～11.14，P<0.01），但TM组和RSG组与T2DM组间无显著差异(P>0.05)。见表2。T2DM组、TM组、RSG组与NC组VCAM1、ICAM1相比，差异有有显著性（F=269.67、311.66，q=17.29～43.15，P<0.01）; TM组、RSG组VCAM1、ICAM1的表达均明显低于T2DM组，差异有显著意义（q=19.42～22.80，P<0.01）。见表2。表2  各组PPARγ、VCAM1和ICAM1阳性细胞率比较（略）

　　3  讨论
   
　　糖尿病血管病变是糖尿病的慢性并发症之一，是糖尿病病人致残、致死的最主要因素。近年来，AS性疾病在T2DM人群中的患病率逐年升高，且发病年龄较轻，病情进展快。糖尿病人群心、脑血管病患病率为非糖尿病人群的2～4倍[2]。
   
　　PPARγ是细胞核内受体超家族成员，PPARγ与配体结合后被激活，可改善胰岛素抵抗，改善糖、脂代谢紊乱[4]，通过对巨噬细胞的影响，抑制炎症反应及平滑肌细胞增殖、迁移，还可通过对血管内皮功能的影响、调节血管张力等，阻止AS的形成[5]。由此可见，PPARγ对血管生物学及炎症反应，特别是AS发生发展过程可以产生重要的影响。VCAM1、ICAM1可促进单核细胞在血管内皮的聚集、黏附且迁移进入内皮下层，摄取脂质转化为泡沫细胞，因此，ICAM1及VCAM1参与了AS的始动环节和早期事件的发生。
   
　　AS是一个复杂的动态过程，具有炎症的基本特征，有变质、渗出和增生等过程，血管内皮的损伤是其发生的启动因素。T2DM伴随的高糖血症、高脂血症、高胰岛素血症使机体氧化能力增强,从而损伤血管内皮细胞[6]。内皮受损害后血浆中的低密度脂蛋白透过损伤的内皮细胞积聚在内皮下间隙并被氧化，导致内皮细胞活化。活化的内皮细胞可分泌ICAM1、VCAM1并聚集循环中的单核细胞和T细胞于内皮下，形成动脉粥样硬化斑块，成为血管性疾病形成发展的关键一步。有研究表明，PPARγ激活可减少血管内皮细胞ICAM1和VACM1的表达，这可能是PPARγ致糖尿病血管并发症及动脉粥样硬化发生发展的机制之一[7]。
   
　　本实验采用高糖高脂饮食制作SD大鼠糖尿病模型，形态学观察显示，T2DM组大鼠主动脉内皮受损明显，大量单核细胞黏附及浸润于内膜，血管平滑肌细胞(VSMCs) 增生，这些都是早期AS 形成的特征。血糖与血脂水平检测显示，血糖显著升高伴胰岛素敏感性降低，说明T2DM模型制作成功[2]。T2DM组、TM组和RSG组血清TC、TG、LDLC水平较NC组显著升高，药物干预组血清TC、TG、LDLC与BG水平较DM组降低，差异有显著性，说明TM和RSG均可以调节糖、脂代谢。主动脉组织免疫组化检测显示，与NC组比较，药物干预组及T2DM组血管壁PPARγ的表达明显升高，3组间差异无显著性，说明在AS形成的过程中某种物质为PPARγ的激活剂，使其表达上升。据文献报道，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）可使PPARγ的表达上调，是AS形成过程中PPARγ的内源性激活剂[8]。本实验结果显示，DM组血浆TC、LDL水平及PPARγ表达明显高于NC组，也证实了这一点。另外，本文药物干预组VCAM1、ICAM1的表达和浸润的单核细胞数明显少于T2DM组，但仍高于NC组。说明罗格列酮和替米沙坦均可通过激活PPARγ，抑制内皮细胞VCAM1和ICAM1的表达，抑制单核巨噬细胞的浸润及VSMCs 表型转化和增殖,降低血管炎症反应，从而保护内皮细胞防止脂质的过氧化，进一步多途径发挥抗早期AS 作用。
   
　　本实验用高糖高脂饮食作为干预因素，因而高糖血症和高脂血症可作为PPARγ一个激活因素。而TM组及RSG组血糖血脂水平较T2DM组显著下降，而其PPARγ表达量却不明显低于T2DM组,说明罗格列酮和替米沙坦有激活PPARγ的作用，从而抑制血管内皮细胞中VCAM1和ICAM1的表达，这可能是其抗AS的机制之一。此外，两药均具有降低血脂、改善胰岛素抵抗、减轻炎症反应等多种有益的生物学效应。
   
　　综上所述，T2DM大鼠主动脉组织VCAM1、ICAM1的表达与PPARγ有关，替米沙坦和罗格列酮可通过激活PPARγ调节VCAM1、ICAM1的表达。本文结果为进一步研究TZDs和ARB的血管保护作用提供了理论基础，并更好地指导两类药物在临床中的应用。

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