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【摘要】 目的 利用组织芯片检测PI3Kp85α、pAkt、Ki67蛋白在胃黏膜、胃腺癌及癌旁组织的表达情况，探讨其意义。方法 用免疫组化技术检测了30例胃黏膜组织、85胃腺癌组织（分为高、中、低分化3种）及其癌旁组织中PI3Kp85α、pAkt及Ki67的表达。结果 PI3Kp85α、pAkt和Ki67蛋白在胃黏膜、癌旁组织及胃腺癌组织中的阳性表达率差异有统计学意义（χ2=41.03～57.58，P<0.01），随病情进展三者表达逐步增强（Hc=6.86～13.30，P<0.05、0.01）。在不同分化程度的胃腺癌中PI3Kp85α、pAkt和Ki67蛋白的阳性表达率差异有显著性（χ2=18.08～18.90，P<0.01），随肿瘤恶性程度增高其阳性表达增强(Hc=15.95～20.10，P<0.01)。PI3Kp85α、pAkt与Ki67蛋白三者的表达两两相关（r=0.82、0.81、0.86，P<0.01）。结论 PI3Kp85α、pAkt和Ki67的表达与胃腺癌的发生密切相关。
【关键词】 胃肿瘤 癌基因蛋白质vmos 蛋白质pAkt Ki67抗原 芯片分析技术
EXPRESSIONS OF PI3Kp85α, pAkt AND Ki67 IN GASTRIC ADENOCARCINOMA
JIAO XUEFEI
(Department of General Surgery, The First People’s Hospital of Qingdao Economic and Technical Development Zone, Qingdao 266555, China);
［ABSTRACT］ Objective To detect expressions of PI3Kp85α, pAkt and Ki67 in normal gastric mucosa, gastric adenocarcinoma and paraneoplastic tissue by using tissue array. Methods The expressions of PI3Kp85α, pAkt and Ki67 in normal gastric mucosa and gastric adenocarcinoma (with welldifferentiated, moderately differentiated, and poorly differentiated) and its paraneoplastic tissue in 30 and 85 cases, respectively, were determined immunohistochemically. Results The differences of expressions of PI3Kp85α, pAkt and Ki67 among normal gastric mucosa, gastric adenocarcinoma and its paraneoplastic tissue were significant (χ2=41.03-57.58;P<0.01), and the positive expression rates increased with the advance of the disesease (Hc=6.86-13.30;P<0.05, 0.01). The differences of the expressions among different grades of differentiations were significant (χ2=18.08-18.90;P<0.01), the expressions increased with the increase of the extent of the malignancy. The is a corelation between each two of them in PI3Kp85α,pAkt and Ki67. Conclusion The expressions of PI3Kp85α, pAkt and Ki67 are closely related to occurrence of the cancer.
［KEY WORDS］ stomach neoplasms; oncogene proteins vmos; proteins pAkt; Ki67 antigen; microchip analytical technique
胃腺癌病死率居消化系统恶性肿瘤之首。已知ⅠA型磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt信号传导通路异常活化与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，但其活性异常是否是胃腺癌发生、发展的重要因素，目前尚不清楚。PI3K家族中，能被细胞表面受体传递的生物调控信号激活者为Ⅰ型PI3K，Ⅰ型PI3K又分为ⅠA和ⅠB两个亚型。由PI3KR1基因编码的PI3Kp85α是ⅠA型PI3K的调节亚基之一[1]，能通过催化Akt被磷酸化为有活性的pAkt，在激活ⅠA型PI3K/Akt信号传导通路的过程中发挥重要作用。为此，我们采用组织芯片和免疫组织化学技术，检测了胃腺癌组织、癌旁组织和对照胃黏膜组织中PI3Kp85α、pAkt和Ki67的表达，探讨其与胃腺癌发生等的关系。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我科2006—2007年手术切除的胃腺癌标本85例，男58例，女27例，年龄25～78岁。85例胃腺癌中低分化45例，中分化20例，高分化20例。另收集30例胃溃疡手术病人胃黏膜组织作为非肿瘤对照组，男21例，女9例，年龄19～60岁。每例标本均经37 g/L中性甲醛固定，常规石蜡包埋制片，并行苏木精伊红染色确定诊断。
1.2 组织芯片制备
用上述组织标本的蜡块制备组织芯片2张，每张芯片包括100个直径1 mm的样点，其中胃腺癌样点85个，对应癌旁组织样点85个，对照胃黏膜组织样点30个。组织芯片制备委托陕西超英生物科技有限公司完成。
1.3 免疫组化染色
组织芯片经枸橼酸高温高压法进行抗原修复后，采用Envision二步法分别进行PI3Kp85α（1∶100）、pAkt（1∶100）及Ki67（1∶100）的免疫组织化学染色。鼠抗人PI3Kp85α和Ki67单克隆抗体及兔抗人pAkt多克隆抗体均购自Santa Cruz公司，山羊抗兔HRP标记二抗、马抗小鼠HRP标记二抗和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.4 结果观察
在装有目镜网格测微尺(6 400 μm2)的400倍视野下计数8个网格中PI3Kp85α、pAkt及Ki67蛋白阳性和阴性的细胞数，按各种阳性细胞占所得细胞总数的百分比，将其分为4个等级：-，无阳性细胞；+，阳性细胞<30%；，阳性细胞占30%～60%；，阳性细胞>60%。
1.5 统计学处理
采用SPSS 11.5及PPMS 1.5[2]统计软件，用χ2检验、H检验、秩和检验及Spearman等级相关对相应数据进行统计学分析。
2 结果
2.1 各组织中PI3Kp85α、pAkt、Ki67的表达
本文构建芯片脱落点由常规切片予以补充。PI3Kp85α、pAkt阳性染色定位于胞浆, Ki67阳性定位于胞核。对照胃黏膜组织中PI3Kp85α、pAkt、Ki67蛋白染色阳性者均以+为主，绝大多数染色为-；癌旁组织中以～为主，呈小灶或弥漫的棕黄色或棕褐色染色；胃腺癌组织中以为主，呈弥漫的棕黄色或棕褐色染色。对照胃黏膜、癌旁和胃腺癌组织中PI3Kp85α、pAkt、Ki67的阳性表达率差异有统计学意义（χ2=41.03～57.58，P<0.01）。PI3Kp85α、pAkt、Ki67蛋白随病情进展其阳性表达逐步增强（Hc=6.86～13.30，P<0.05、0.01）。见表1。 表1 不同组织PI3Kp85α、 pAkt 及 Ki67阳性表达率及阳性等级构成的比较（略）
2.2 高、中、低分化胃腺癌组织PI3Kp85α、pAkt、Ki67的表达
PI3Kp85α、pAkt、Ki67蛋白在高、中、低分化胃腺癌组织中阳性染色呈弥漫棕黄色或棕褐色。PI3Kp85α、pAkt、Ki67蛋白在高分化、中分化及低分化胃腺癌组织中的阳性率差异有统计学意义（χ2=18.08～18.90，P<0.01），并且随着恶性程度的升高，其阳性等级升高(Hc=15.95～20.10，P<0.01)。见表2。表2 不同分化胃腺癌组织PI3Kp85α、pAkt及Ki67阳性表达率及阳性等级构成的比较（略）
2.3 PI3Kp85α、pAkt及Ki67蛋白表达的相关性分析
PI3Kp85α、pAkt与Ki67蛋白三者的表达均相关（r=0.81～0.86，P<0.01）。
3 讨论
研究胃腺癌的发病机制，尽早诊治是治疗该病的关键。现已知ⅠA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或Akt)所组成的信号通路是胃腺癌发生发展的关键途径,并且在其他恶性肿瘤如结直肠癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、口腔鳞癌中均发现有该通路上的蛋白分子如PI3Kp85、PI3Kp110、Akt等的突变或过表达[34]。ⅠA型PI3K是调节亚基p85和催化亚基p110构成的专性的异二聚体[1]。PI3Kp85α对PI3K的激活是通过PI3Kp85α的SH2结构域与受体酪氨酸激酶（RTK，如EGFR）磷酸化酪氨酸残基的结合实现的。当生长因子及其受体结合后可以导致RTK中酪氨酸的自身磷酸化，从而使p85的SH2结构域发生构象变化，p85/p110募集至细胞膜上的RTK并定位在细胞膜的内表面上；PI3K一旦在细胞膜内表面定位即被激活。
本研究中PI3Kp85α、pAkt在对照胃黏膜组织、癌旁组织及胃腺癌组织中的阳性率具有统计学差异（P<0.01），而且随病情的进展其阳性等级逐步增高（P<0.05），提示ⅠA型PI3K/Akt级联反应信号的放大也能导致胃腺癌的发生。pAkt是Akt蛋白Ser308或Thr473磷酸化后的活性形式[5]，既往已有报道pAkt阳性的乳癌及前列腺癌病人的预后较差[6]。最近有文献研究证实胃腺癌组织中pAkt的阳性表达程度与病人的预后呈负相关关系，并且pAkt易导致术后病人化疗药物的耐药[7]。在本研究中，PI3Kp85α、pAkt蛋白的阳性等级随胃腺癌恶性程度的增高而增高（P<0.01），由此推测联合检测PI3Kp85α、pAkt两种指标的阳性率也能反映胃腺癌的恶性程度和预后。Ki67系细胞增殖相关蛋白，在G1、S、G2、M期细胞核中表达，G0期不表达，能较好地反映肿瘤细胞的增殖活性。本文结果显示，PI3Kp85α与Ki67在胃腺癌中的表达是相关的（P<0.01），因此，PI3Kp85α与肿瘤的增殖密切相关。最近研究发现，PI3Kp85α是一种独立的信号分子，在细胞胞浆分裂中发挥重要作用[8]，其促进增殖的机制是否与其在胞质中分裂中的作用有关仍需进一步研究。齐鲁医学杂志2010年4月第25卷第２期 Med J Qilu, April 2010, Vol.25, No.２
由于PI3Kp85α、pAkt和Ki67在胃腺癌及癌旁组织中的阳性率及阳性等级构成比高于对照胃黏膜组织（P<0.05），并且3种蛋白在胃腺癌中具有明显的相关性，因此当3种蛋白阳性率同时升高时胃腺癌的发生概率增加。总之,本研究证明ⅠA型PI3K/Akt信号通路级联反应地放大与胃腺癌的发生密切相关，同时PI3Kp85α蛋白作为激活该通路的必要环节，为我们提供了一个新的治疗胃腺癌的靶点。
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