壳寡糖对兔骨关节炎的治疗效果

【摘要】  目的探讨关节腔内注射壳寡糖对兔骨关节炎的治疗效果及其作用机制。方法新西兰兔12只，于右膝关节腔内各注射4 g/L的木瓜酶溶液0.3 mL，随机分为生理盐水对照组及20 g/L的壳寡糖实验组。自造模7 d后右膝关节开始给药，每周1次，共5周。于末次给药后7 d以空气栓塞法处死动物，关节软骨及滑膜组织以苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察其病理变化，免疫组织化学染色法检测膝关节软骨及滑膜组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果HE染色表明,实验组退变软骨及滑膜的病理变化轻于对照组，免疫组织化学染色法显示,实验组TNF-α 的表达明显低于对照组。结论壳寡糖能够明显降低骨关节炎滑膜、软骨组织中TNF-α的表达水平，延缓软骨的退变程度，可能成为一种新的骨关节炎治疗药物，值得进一步研究、开发和利用。

【关键词】  壳寡糖;骨关节炎;肿瘤坏死因子α;治疗结果

　ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of intraarticular injection of chitosan on osteoarthritis in rabbits.　　MethodsA model of osteoarthritis was created in 12 New-Zealand rabbits by injecting 0.3 mL of 4 g/L papain into articular cavity of the right knee. The rabbits were randomly divided into two group: chitosan-experiment and normal-saline-control. Medication was started seven days after the creation of the models, once a week for five weeks. All rabbits were sacrificed by aeroembolism seven days after the last medication. The pathology of cartilage and synovium of the knee joint was examined by HE staining and expression of TNF-α detected by immunohistochemistry.ResultsIn comparison between the two groups, HE staining indicated that pathological changes of the cartilage and synovium were milder in the experiment group than the control; immunohistochemically, the expression levels of TNF-α were lower.ConclusionChitosan oligosaccharide can obviously reduce the expressions of TNF-α in cartilage and synovium of osteoarthritis, delay the course of cataplasia of the cartilage, which can possibly become a new drug worth further research, development, and exploitation for the therapy of this condition.

　　[KEY WORDS]chitosan oligosaccharide; osteoarthritis; tumor necrosis factor-alpha; treatment outcome

　　骨关节炎(OA)是临床上一种常见病和多发病，常常影响病人的关节功能，严重者将影响病人的生活质量。目前，临床尚未发现一种高效、安全治疗OA的药物。许多研究表明，甲壳素及其衍生物具有作为软骨细胞生长载体和促进软骨修复的能力，其中壳寡糖，也称几丁寡糖，是以壳聚糖为原料，经生物技术降解而成的水溶性好、功能作用强、生物活性高的低分子量产品。壳寡糖在人体内吸收率近100%，其功效是壳聚糖的数十倍。本实验通过OA实验动物模型，观察壳寡糖治疗兔膝关节OA的效果。现将结果报告如下。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物

　　健康清洁级新西兰兔12只，体质量为2.5～3.0 kg, 雌雄不限，由青岛市药品检验所提供，合格证编号：SCXK(鲁)20090007。

　　1.2主要试剂

　　壳寡糖由中国海洋大学提供，木瓜酶由Solarbio公司提供，兔抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体及免疫组织化学染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司，浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3模型的制备及动物分组

　　将兔仰卧固定于实验台上，刮去右膝关节处毛发，常规消毒，各关节腔内注射4 g/L木瓜酶溶液0.3 mL(1 mL生理盐水中含4.0 mg木瓜酶、50 mg盐酸半胱氨酸,该溶液无菌条件下过0.22 μm滤膜) 建立OA模型。随机分为生理盐水对照组和20 g/L的壳寡糖实验组。

　　1.4实验方法

　　对照组动物造模侧膝关节腔内注射生理盐水0.3 mL，实验组于造模侧膝关节腔内注射20 g/L的壳寡糖0.3 mL。每组分别于造模后7 d开始给药，每周1次，连用5周。

　　1.5兔膝关节软骨病理观察

　　于末次给药后7 d以空气栓塞法处死动物，迅速刮去兔膝关节处毛发，以锋利刀片取出完整关节滑膜和软骨，按常规进行固定、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察。

　　1.6TNF-α的检测

　　采用免疫组织化学法进行检测。具体步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。体积分数0.03的去离子水孵育5～10 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温下20 min，倾去，勿洗。滴加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次3 min。滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min。DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，PBS或自来水冲洗10 min。 脱水、透明、封片、镜检。

　　2结果

　　2.1光镜下软骨及滑膜的病理改变

　　HE染色显示，生理盐水对照组软骨细胞排列紊乱，数量减少，部分软骨囊内细胞核消失，胞浆浓缩、红染，部分区域软骨细胞减少;滑膜组织增生，间质疏松水肿，伴大量浆细胞及淋巴细胞浸润，软骨部分区域表面有缺失。壳寡糖实验组可见软骨细胞大致正常，有簇集样细胞团伴钙化;滑膜组织轻度增生，中性粒细胞浸润轻，间质水肿不明显。

　　2.2兔软骨及滑膜细胞中TNF-α的表达

　　TNF-α阳性结果为细胞胞浆呈棕黄色。免疫组织化学染色可见，生理盐水对照组大多数细胞TNF-α表达阳性，且阳性信号较强。而壳寡糖实验组仅有少数TNF-α表达，且阳性信号较弱。

　　3讨论

　　本文用木瓜蛋白酶关节腔内注射建立OA实验动物模型，其机制可能在于木瓜蛋白酶能导致硫酸软骨素从关节软骨基质中的蛋白多糖复合体上分离、释放，而该蛋白大分子的缺失必然导致软骨基质的理化性质和电学特性发生改变，同时伴有胶原的暴露，使得软骨承受过多的张力和剪切力，导致关节退变。杨峰等[1]将16 g/L的木瓜蛋白酶0.3 mL注射到兔颞颌关节，结果显示注射后第2周颞侧关节面纤维变性，软骨浅层破坏;第4周可见退行性变进行性加重,表现为关节面软骨层广泛破坏、骨面粗糙不平、骨质破坏及骨赘形成;第6周关节面粗糙不平,软骨细胞增殖,但纤维软骨层薄,纤维变性,周围的软骨细胞成簇增生,符合OA改变。研究表明，木瓜蛋白酶关节内注射可诱导狗、兔及豚鼠等动物髋关节或膝关节OA[2-3]，该模型特点是发病速度快，重复性好，与人类OA类似。

　　近年研究表明，TNF-α是由巨噬细胞、纤维母细胞、软骨细胞等分泌的一种负调节因子,能够引起软骨基质的吸收、破坏, TNF-α可刺激产生一氧化氮合酶(iNOS)[4]。iNOS是一氧化氮 (NO)产生过程的关键酶,是OA发病过程中诱导软骨细胞凋亡及高表达多种基质金属蛋白酶而导致软骨降解退变的重要炎性递质。一旦iNOS蛋白合成，使NO水平升高，升高的NO导致软骨和滑膜的损伤，进一步促进炎性因子的释放，诱导iNOS的生成，形成恶性循环，使软骨处于不良的微循环中，导致软骨进行性退变[5]。 研究显示，TNF-α可以刺激滑膜与软骨细胞合成胶原酶与前列腺素E2(PGE2)，刺激软骨细胞合成金属蛋白酶与丝氨酸蛋白酶，进而导致软骨细胞外基质的降解。因此，TNF-α是OA发病过程中的重要影响因子。

　　研究显示，甲壳素及其衍生物具有作为软骨细胞生长载体和促进软骨修复的能力[6-7]。壳寡糖作为甲壳素的衍生物，具有水溶性好、功能作用强、生物活性高的特点。本实验的结果表明，关节腔注射20 g/L的壳寡糖能够显著减轻OA软骨退变的程度，抑制OA软骨TNF-α的表达，提示壳寡糖具有软骨保护作用。我们认为其作用机制可能有以下几个方面：①壳寡糖与正常关节液相似，具有黏弹性，可模拟关节滑液的物理作用，减轻关节软骨面的压力。②OA病程中出现细胞因子分泌异常，TNF-α等细胞因子大量聚集，导致软骨退变。壳寡糖通过抑制TNF-α的产生，从而减轻滑膜炎症,降低炎症递质对软骨的破坏,加速软骨的合成代谢,有利于软骨的修复[8-9]。同时，壳寡糖能积聚于软骨表面形成屏障，阻止软骨降解酶与软骨接触，防止软骨基质的进一步降解。③NO是OA发病过程中诱导软骨细胞凋亡及高表达TNF-α而导致软骨降解退变的重要炎性递质,甲壳素类物质能够抑制巨噬细胞产生NO的能力[10-11],所以壳寡糖有可能通过抑制NO的产生而延缓OA软骨细胞退变。

　　本研究结果表明，壳寡糖能够促进滑膜、软骨修复，降低关节滑液中的炎性递质,有效改善OA症状，而且具有水溶性好、价格低廉等优点，因此是一种具有潜力的新一代治疗OA药物，值得进一步研究、开发和利用

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