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【摘要】 单克隆抗体从问世到应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中基因工程抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新。利用抗体工程技术可研制出性能和特点各不相同的高效治疗性抗体，如增强效应功能的全长抗体、传递细胞毒作用的免疫毒素、抗体与细胞因子连接的融合蛋白，以及锚定多种受体的双特异抗体等。本综述介绍了近年来治疗性抗体工程的进展。
【关键词】 工程抗体；治疗性抗体；双特异抗体；效应功能
Progress and application of new-style engineering antibody used for therapeutic
PENG Zhuo-chun，MA Duan.
Fudan University, Key Laboratory of Molecular Medicine, Ministry of Education, Shanghai 200032, China
【Abstract】 When monoclonal antibody comes into being，it has been an uneven way in its widely clinical applications. But the engineered antibody sets an important milestone with a series of technology renovations .A diversity of engineered antibody forms have been created to improve their efficacy, including enhancing the effector functions of full-length antibodies, delivering toxins to kill cells or cytokines in order to stimulate the immune system, and bispecific antibodies to target multiple receptors and so on. The review almost focuses on this new progress of engineering antibody used for treatment.
【Key words】 engineering antibody;therapeutic antibody;bispecific antibody;effector function
自从1975年Khler和Milstein 应用杂交瘤细胞产生单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)以来，有关mAb的研究及应用获得了长足的进展。由于治疗性mAb具备特异性强、能够携带其它分子等特点，在临床前和临床研究中获得了其它药物无法达到的疗效，引起了人们极大的关注。
为了适合临床应用，对mAb必须进行适当的改造或修饰，以降低或去除人体对mAb的免疫反应，增强mAb的功能。在降低免疫原性方面，mAb经历了鼠源单抗、鼠/人嵌合单抗、人源化单抗、人源单抗等几个阶段，鼠源性蛋白的成分逐步减少，最终下降为零。mAb免疫原性下降延长了在体内的半衰期，使长期治疗成为可能。对mAb改造的另一个方向是让其携带某种特定的分子，如同位素、细菌毒素、炎性细胞因子、趋化因子或药物前体分子等，起到靶向杀伤肿瘤细胞的作用。此外，对mAb分子结构进行改造，增加与抗原的结合能力和抗体效应功能，也是新型治疗性抗体研究的重要方向［1,2］。
1 双特异抗体 (Bispecific antibody，BsAb)
BsAb是指具有两种抗原结合特性的抗体，可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇。与mAb相比，BsAb具有以下优点：(1)较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；(2)对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有杀伤或抑制作用；(3)激活结合的细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte，CTL)，发挥多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。
早期研制 BsAb 的方法是采用细胞工程，即将两株各自分泌不同特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞再融合得到四源杂交瘤 (quadroma)，或将一株杂交瘤细胞与免疫的脾细胞融合得到三源杂交瘤，这两种杂交瘤被称为二次杂交瘤(hybrid-hybridoma)。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。20世纪90年代起，基因工程和蛋白质工程在抗体生产和改造中得到了成功应用，由此产生了抗体工程。应用抗体工程生产BsAb，具有分子量小、方法稳定、可大量生产、成本显著降低和操作简便等优点。
1996年，Ridgway 等人［3］ 首次将“knobs into holes”技术应用到BsAb异源双聚体形成的制备上，此后Merchant［4］ 和Xie［5］进一步发展了该技术。“knobs into holes”的设计思路很巧妙，主要是通过突变两条重链结合面上的某些氨基酸，使原来无法结合的免疫球蛋白（Ig）重链牢固结合。通常采用的方法是：将一条 IgG 重链上CH3结构域中的氨基酸突变为带小侧链的氨基酸 (hole)，将另一条 IgG 重链上与之相对应的氨基酸突变为带大侧链的氨基酸 (knob)，然后共转染编码这两条重链的基因至同一真核宿主细胞表达。由于 knob 和 hole 氨基酸特殊的相互作用，使两条重链形成的二聚体可以达到90%以上。2005年，Xie Z等［5］应用该技术先将抗人表皮生长因子－2 (HER2/neu)和抗CD16两个单链可变区抗体在同一CHO细胞中实现表达，然后应用人IgG1 Fc段的CH3结构域将两者结合，形成异源二聚体形式的BsAbs，该二聚体具有特异性结合HER2/neu和CD16的功能。与其它哺乳细胞表达的工程BsAbs相比，该BsAbs产量较高(12～14 mg/L），体外实验显示能够动员人外周单核细胞杀灭SK-BR-3肿瘤细胞，作用明显强于罗氏公司生产的商品化抗 HER2/neu 抗体 Herceptin。全长型BsAb分子中含有Fc段，由于它能够结合Fc γ 受体 (FcγR，一种细胞表面的细胞毒效应触发分子)，故可激活免疫系统的效应细胞以杀死肿瘤细胞。应用抗体工程改造BsAb，使其与FcγR结合能力提高，亦是BsAb研究的一个重要方面。经过改造，BsAb可以与IgA受体 (FcαRI) 发生高亲和力结合，其作用甚至强于抗FcγR的BsAb对肿瘤细胞的杀伤作用［6］。
2 抗体－细胞因子融合蛋白 (Antibody-cytokine fusion proteins)
细胞因子能激活某些免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞 、NK细胞、T细胞和B细胞等。应用细胞因子治疗癌症能够引起免疫应答，但这种免疫反应是非特异的，常产生全身毒性。有人尝试使用抗体工程技术将细胞因子与抗体连接形成融合蛋白，通过靶向作用，细胞因子在肿瘤组织的靶细胞上聚集，在局部杀伤肿瘤细胞，而非特异性毒性将减少或消失［7］。常用的细胞因子包括IL-2、IL-12和GM-CSF 等，融合的部位可以是全长型抗体或ScFv的N端或C端。抗体－细胞因子融合蛋白作为一种新型的肿瘤免疫治疗药物，其抗体功能域可引导细胞因子浓集在肿瘤组织的微环境中，之后抗体部分直接抑制肿瘤细胞活性，并诱导二次免疫应答，多重作用的相加使抗体－细胞因子融合蛋白对肿瘤的抑制作用明显强于单独使用抗体或细胞因子。由于全长型抗体Fc上存在两个效应细胞结合位点，功能更为强大，其中一个位点与细胞因子结合，激活效应细胞，另一个与FcγR结合，引发抗体依赖细胞的细胞毒作用 (Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。
近年来已有多种抗体－细胞因子融合蛋白问世，如抗体－IL-2融合蛋白［8］和抗体－IL-12融合蛋白，后者是将抗纤连蛋白ScFv的重链结构域N端与IL-12融合，结果产生较强的抗肿瘤活性，这主要是因为该融合蛋白显著增加了免疫效应细胞对肿瘤的渗透，并增强了T细胞对肿瘤细胞的排斥反应［9］。有人还研制出能够同时与两种细胞因子融合的抗体，即抗体的N端和C端分别连接了不同的细胞因子(IL-2、IL-12、IL-4或GM-CSF)，抗肿瘤的功能更加显著［10］。这些进展证明抗体－细胞因融合蛋白有着广阔的使用前景。
3 免疫毒素 (Immunotoxins，ITs)
ITs是一种毒素肽和细胞选择性靶向配体连接的融合蛋白，它能通过靶向结构域的特异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之作用进而杀死肿瘤细胞。早期的ITs是由无修饰生物毒素和鼠源抗体（如全长IgG）连接而成的，连接的方式常为化学偶联法。由于非人源的毒素和鼠源抗体导致的免疫排斥反应，以及低亲和力和无靶向特异性，使ITs无法在临床中得到运用。
新型ITs是将毒素肽和细胞选择性靶向配体都进行改造后，再用工程菌或工程细胞实现高效表达。细胞选择性靶向配体使用了工程抗体、转铁蛋白、表皮生长因子以及IL-2等［11］。抗体的改造主要集中在降低免疫原性、提高亲和力和增强实体肿瘤渗入率等方面，包括改用小分子工程抗体（Fab、ScFv/dsFv）、人源化抗体、人源抗体和突变的高亲和力抗体等。Mitchell Ho等［12］通过对人抗体的胚系基因热点突变（germline hot spot），得到了亲和力显著提高的人源噬菌体抗体库筛选表达的ScFv。通过对比现有抗体cDNA序列和抗体库中的胚系基因，可以找出位于CDR（complementarity determining region）的突变热点－RGYW（R＝A/G，Y＝C/ T，W＝T/A）基序，这些基序与胚系基因一致的是胚系热点，与体细胞突变序列一致的是非胚系热点或体细胞突变热点。研究表明，胚系热点数越多，抗体亲和力越低。突变含多个胚系热点的抗体基因，将使其亲和力大大提高。
D. Vallera 等人［13］用低聚集连接短肽 (Aggregation reducing linkers，ARL) 代替经典的 Gly4Ser 连接短肽，以毒素肽－（VH－ARL－VL）－Gly4Ser－（VH－ARL－VL）的连接形式构建了一种新型的二价单链抗体毒素融合蛋白Bic3 。与一价ITs相比，Bic3因减少了前体蛋白的聚集反应，增加了折叠正确的ScFv蛋白形成，加上二价结合力，因此具有更强的亲和力。He D等［14］利用精氨酸富集肽具有促进细胞内化作用的特点，设计出的 ITs 中含有九个精氨酸短肽，增强了内化作用，使 ITs 药效得到了提高。
以往 ITs 常用的生物毒素有［15］：(1)细菌毒素，如白喉毒素和假单胞菌外毒素；(2)植物来源的核糖体失活蛋白 (RIP)，如蓖麻毒蛋白和天花粉蛋白；(3)真菌毒素，如α－sarcin等。新一代的生物毒素则是经过修饰后降低了免疫原性的毒素肽，如用聚乙烯乙二醇修饰的毒素，人源化毒素等，完成了从传统免疫毒素治疗到抗体导向酶前体药物治疗（Antibody－directed enzyme prodrug therapy，ADEPT）的跨越。例如，蓖麻毒素A能引发血管渗漏综合征（Vascular leak syndrome），原因是它有一个与血管内皮细胞结合的三氨基酸结构域位点，引导了蓖麻毒素A与内皮细胞结合，然后发挥出毒性作用。如果将该结构域突变，可使它与内皮细胞结合能力明显下降，因此毒性也明显下降［16］。一种从海葵里提取的溶细胞素－Sticholysin I ，也可用来做ITs的毒素功能域，因为它有强烈的细胞膜孔化作用，可以使肿瘤细胞破裂［17］。
4 抗体的效应功能
mAb能产生四种效应功能：ADCC、吞噬作用、补体依赖的细胞毒作用(Complementdependent cytotoxicity，CDC)、影响半衰期或清除率。ADCC和吞噬作用是由抗体与FcγR相互作用介导的，CDC则通过细胞外结合的抗体与启动补体效应的蛋白相互作用造成的，半衰期效应则是由于抗体与新生Fc 受体(Neonatal Fc receptor, FcRn)结合引起的。
针对ADCC、吞噬作用及CDC抗体效应功能的抗体工程主要集中在对Fc的改造上，以增强抗体与FcγR的相互作用，最终增加效应功能。全长型抗体有两个N糖基化位点，它们介导了Fc与FcγR结合诱发的ADCC效应，进而也诱导了FcγR相连的细胞，活化了细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T -lymphocyte，CTL）的应答反应。通过基因突变和糖基异构的方法，优化Fc和FcγRs相互作用，能增强抗体抑制肿瘤的作用。IgG 297Asn的糖基化构成了寡聚糖连接中心，与其连接的盐藻糖能连接多种单糖，盐藻糖部分缺失能显著增强抗体与FcγRIII的结合能力及继发的ADCC效应。Katsuhiro Mor等［18］运用RNA干扰技术，在中华仓鼠卵巢细胞（CHO）中下调IgG糖基化关键酶－盐藻糖基转移酶8（a1,6 fucosyltransferase，FUT8）的表达，使抗体去盐藻糖化，结果该抗体的ADCC效应增强了100倍，该CHO的表达特性还可以遗传至子代细胞。此外，完整的人源IgG1与FcγR结合的氨基酸序列图谱的成功解析，有助于研制各种IgG1突变体，以提高它们与FcγR结合的能力。这些突变体甚至能与低亲和力的FcγRIIIA高效结合，并使ADCC效应增强［19］。
IgG的另一效应功能是半衰期效应。通过改变Fc残基，可以达到延长半衰期的目的，并提高抗体与FcRn的结合能力。人IgG和FcRn抗原决定簇相互作用的空间结构已解析，对其部分关键残基改造后，可以增强它们的结合强度以延长半衰期。FcRn从结构上来说是MHC I 型分子，由一个α链和一个β2微球蛋白以非共价形式结合。FcRn在脑微血管系统表达，功能是将脑组织中的IgG运输到血液。工程改造后不结合FcRn的抗体可用来治疗脑癌，原理是减少抗体从脑入血的运出率。必须注意的是，IgG与FcRn的结合与pH值密切相关，两者只能在pH6.0时结合，pH7.4则不行［20］。
近年来，抗体新效应功能也受到关注。Basta M 等［21］发现不含Fc区的F(ab)'2 也可诱导抗体的效应功能，进一步研究发现F(ab)'2 中的恒定区可以与过敏毒素（C3a或C5a，补体3和补体5的蛋白酶消化片段）起中和反应，激发效应细胞的效应功能。当非特异IgG与C3a或C5a作用时，也发现有很强的效应功能，分子模拟研究表明它们之间的结合位点不包含Fc区。
5 结论
利用抗体工程研制更有效的治疗性抗体的前景非常光明。实践已经证明，许多新型工程抗体可以在原核或真核细胞中实现高效表达，它们具有较长的半衰期和生物学效应，大多为ScFv、Fab或它们的多聚体，能够有效进入肿瘤细胞，具有比较理想的治疗效果。新型抗体工程技术的不断出现，将为抗体改造提供了强有力的技术平台。相信不久的将来，治疗性抗体会在人类疾病的治疗中扮演重要的角色。
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基金项目：上海市重大科技攻关资助项目(04DZ19104)和教育部科学技术研究重点项目(105064)
作者单位： 200032 上海， 复旦大学分子医学教育部重点实验室
(编辑：文 静)