天然生物支架材料在软骨修复中的研究进展

    关节软骨缺乏再生能力，外伤或疾病引起的软骨缺损需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，但可引起免疫排斥反应，而导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chertman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。1977年，Green等以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是作者第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复。当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成支架材料无可比拟的优势。本文就天然生物支架材料在软骨修复中的现状和研究进展做如下综述。

    1  天然脱细胞生物支架材料

    天然脱细胞生物支架材料主要利用同种或异种器官／组织，经脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。细胞外基质(ECM)是由细胞自身分泌组成的并围绕在细胞周围主要含有胶原蛋白、纤维蛋白粘连素、层粘连蛋白，层连素等。细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。目前已经有研究应用同种异体脱细胞材料修复膀胱、尿道、动脉和皮肤缺损［1～3］，以及构建心脏瓣膜［4］，结果比较满意。另外关于脱细胞软骨基质和小肠粘膜下基质(SIS)这2种天然的细胞外基质材料应用也有相关的研究报道［5～7］。

    脱细胞基质材料具有多种天然细胞外成分，有利于细胞的吸附，增殖和分化并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存在；并且具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长而重建软骨，在未来组织修复中它们将拥有广泛的应用前景；但其脱细胞后的孔穴大小及孔穴间的连接缝隙的大小制约着种植细胞向深层发展。

    2  胶原支架材料

    胶原是人体内含量最丰富的蛋白，占人体蛋白总量的30％以上，其中以细胞外基质中胶原蛋白含量最高。胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在，其基本组成单位是原胶原分子，原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。胶原纤维与细胞外基质中其它成分形成结构与功能的复合体。胶原作为天然的生物材料，其本身无毒性，可被细胞酶类识别、标记、降解，有利于软骨细胞黏附、增殖和分化，还可刺激移植组织产生新的胶原，并且降解产物可被机体吸收。

    Wakitani等用Ⅰ型胶原凝胶与软骨细胞或间充质干细胞混合后修复兔膝关节软骨的全厚度缺损，取得较为满意的结果［8,9］。Wambach等从狗甲状软骨上获得的软骨细胞种植到牛Ⅰ型胶原纤维上体外培养，结果发现甲状软骨细胞在Ⅰ型胶原基质中，通过产生Ⅱ型胶原，表达自身表型［10］。Stone等设计了一种用作半月板再生的胶原支架，经FDA批准后在10位病人身上作了初步的临床实验［11，12］。实验结果表明，胶原支架是可移植的，而且在3 a的植入期内是安全的，支架支持半月板缺损的组织再生，在连续的血清学测试中未发现不良的免疫反应。术后6个月通过关节镜检查发现新生成的软骨组织替代了已被吸收的原植入物。Lee用Ⅱ型胶原作支架培养软骨细胞，结果表明细胞生长和功能表达良好［13］。这些结果表明利用胶原材料作为基质支架开发组织工程化软骨是可行的。

    Ⅰ、Ⅱ型胶原由于含有特别的识别信号，有利于软骨细胞粘附、增殖、分化，可作为良好的材料包埋添加剂。缺点是缺乏一定的机械强度，难于塑形，支架材料在体内降解过快，新生软骨组织生化组成也难于评价。另外，由天然生物材料制备的胶原，每批产品之间，还存在着生化性质的差异。

    3  纤维蛋白支架材料

    纤维蛋白凝胶在软骨组织工程中的应用仅排在聚乳酸(polylacticacid，PLA)、聚羟基乙酸(PolyGlycolic Acid，PGA)和胶原材料之后。纤维蛋白与胶原一样，本身就来自天然的细胞外基质，因此，也具有很好的生物相容性。纤维蛋白凝胶是纤维蛋白单体在凝血酶作用下聚合成的具有可塑形、可黏附性、可降解性及生物相容性的立体网状结构凝胶，它可通过减慢凝血酶的聚集，因而减慢它从液态转变为凝胶的过程，为凝胶的塑形提供充分的时间。纤维蛋白凝胶聚合时能释放血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子β(TGFβ)，有趋化性和致有丝分裂作用，能进一步促进细胞增殖、黏附和基质分泌。用这种凝胶包埋软骨细胞，为细胞的生存提供了三维空间支持。纤维蛋白凝胶的大小和形状能够根据需要而塑形，为组织工程化软骨提供了一种可选择的聚合物支架。来源于自身血液制备的纤维蛋白凝胶，避免了免疫原性问题，可直接用于临床，具有取材简单、制备方便、韧性好等优点［14］。Hendrickson等将软骨细胞-纤维蛋白原-软骨-凝血酶混合物注入马软骨缺损区，1个月后形成类透明软骨，内含大量的糖胺多糖和Ⅱ型胶原［15］。Silverman等将纤维蛋白与凝血酶混合产生纤维蛋白凝胶，再与猪软骨细胞混合，注射到裸鼠皮下，在6、12周收集新形成的软骨，通过组织学检查及糖胺多糖、DNA和胶原Ⅱ含量分析，细胞浓度为40×104／ml时在6、12周形成固体软骨，较对照组(仅注射软骨细胞或纤维蛋白胶组)有显著差异，因此认为，纤维蛋白胶对于可注射组织工程软骨是一个合适的聚合物［16］。Meinhart的研究工作也支待上述观点［17］。Van Susante等在羊的股骨髁制造全层软骨缺损，然后将兔软骨细胞和纤维蛋白胶原混悬液植于缺损处，研究显示纤维蛋白凝胶作为三维支架材料不能提供足够的生物机械支特［18］。Sims等利用血纤维蛋白单体聚合成凝胶用作基质支架，将浓度为12～15×106 cell／ml的软骨细胞—支架复合物植入裸鼠体内，术后12周发现有新的软骨生成。作者还将人的肋骨软骨细胞接种在纤维蛋白凝胶支架上，然后植入裸鼠皮下，也取得了很好的实验结果［19］。

    纤维蛋白胶可促进细胞的粘附、增殖和基质分泌，但作为三维支架材料它不能提供足够的机械强度，这也是天然生物材料的共同缺点，再者它来自血液，大量获取困难，但在非承重区的小范围软骨修复中仍不失为一种较好的支架材料。

    4  糖胺多糖

    糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)是软骨细胞增殖、分化的标志性产物。在体内GAG与蛋白质结合成为蛋白多糖(proteoglycan，PG)，构成细胞外的四大成分之一，可促进细胞的粘附、增殖、分化。人体内存在7种糖胺多糖：透明质酸(hyaluronicacid，HA)，4硫酸软骨素(chondroitin　4　sulfate，CH4S)，6硫酸软骨素(chondroitin　6　sulfate，CH6S)，硫酸皮肤素(demaransulfate，DS)，硫酸角质素(karatansulfate，KS)，肝素(heparin，HP)和硫酸肝素(heparansulfate，HS)。

    Aigner等研究半合成可吸收物质透明质酸苯甲基硫(Hyaff11)在软骨重建组织工程中人鼻中隔软骨细胞培养的支架的可能性，研究证实Hyaff11无纺网支架在软骨移植组织工程中有很好的发展前景［20］。Grigolo等用Hyaff11无纺网与软骨细胞混合培养修复软骨缺损，在第24周时，已有透明软骨生成［21］。另外研究表明透明质酸及其衍生物支架有利于软骨细胞的粘附、迁移、增殖与分化，并且促进其中生长的软骨细胞合成和分泌细胞外基质［22,23］。这种糖胺多糖支架在自体软骨细胞移植中具有一定潜力，在软骨组织工程中有较好的应用前景。

    5  几丁质

    几丁质是一种天然高分子有机多糖，亦称甲壳质、甲壳素、壳聚糖。其化学名称为β-(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。这类天然多聚糖有明显碱性，良好的生物相容性和生物可降解性。几丁质所有降解产物对人体均无毒性、无刺激、无免疫原性、无致突变效应［24］。该材料具有广谱的抑制细菌、霉菌的作用，能促进上皮细胞生长和创面愈合，且来源广泛、价格便宜。Lahiji等在包被和未包被几丁质的塑料盖玻片上种植人软骨细胞和成骨细胞，培养7 d用荧光分子探针评价细胞活性，RT-PCR和免疫组织化学分析软骨、成骨细胞的表型表达。几丁质包被的细胞在玻片上成骨和软骨细胞表现为圆形和折光性。相反在塑料玻片上90％的细胞变长或呈纺锤形。RT-PCR和免疫染色证实在几丁质上成骨细胞表达I型胶原、软骨细胞表达Ⅱ型胶原［25］。在体外研究证实，具有生物相容性的几丁质作为基质材料可促进成骨和软骨细胞生长并保持其功能，几丁质作为组织工程支架材料，具有修复骨和软骨缺损的潜能。

    6  藻酸盐

    藻酸是从海藻中分离出来的一类多糖聚合物。藻酸钙水凝胶可保持较好的形状，并且藻酸钙无毒性，在组织培养中用于细胞培养载体。Paige等采用藻酸钙水凝胶复合牛肩关节软骨细胞做成圆盘状移植物，移植于裸鼠背部皮下，8、12周后形成新鲜软骨［26］。Fragonas等研究了藻酸盐凝胶混合同种异体软骨细胞，体内修复全层损伤的兔关节软骨，4～6个月后，软骨细胞移植物完全修复缺损，并恢复到正常组织结构［27］。藻酸盐水凝胶与其他聚合物相比，价格低、来源丰富、易塑形、具有更好的亲水性，易于细胞吸附，营养物质易于渗透等特点；它本身不是软骨细胞外基质的天然成分，与PLA、PGA等特定形状聚合物材料相比，藻酸钙水凝胶具有亲水性好、营养物质易于渗透、可预先制成各种形状、能为细胞提供良好的三维生长环境并能保持良好形态等优点。藻酸钙水凝胶在生物体内以酶解方式生成甘露糖醛酸和葡萄糖醛酸单体，对机体无毒性、无免疫原性［28］。但藻酸钙也存在组成成分不稳定，不同成品纯度不一，藻酸钙的纯度不够会导致一定程度的免疫原性和较差的可吸收性。

    7  蚕丝蛋白

    蚕丝蛋白直接来源于蚕的腺体蛋白，经分离和鉴定，它是一种多肽，Inoue等研究发现，家蚕分泌的丝蛋白包括一个重链，一个轻链和一个精蛋白P25，重链和轻链由二硫键连接，P25以二硫化合物通过非共价键形式结合。蚕丝蛋白定量酶联免疫吸附试验显示，重链、轻链、P25的克分子比为6：6：1［29］。Inouye等检测了动物贴壁细胞在蚕丝蛋白、胶原、聚苯乙烯3种材料包被的培养皿中生长情况，发现蚕丝蛋白和胶原蛋白包被的培养皿，细胞生长情况基本一致，均较在聚苯乙烯包被的培养皿中生长的细胞高出30％～50%［30］。Santin等评价蚕丝纤维膜的炎症反应，并与2种物理-化学性质完全不同的物质聚苯乙烯、2-羟乙基一甲基丙烯酸酚作对比，蚕丝膜引起的炎性反应要少于高分子材料［31］。天然材料本身包含很多生物信息，能够使细胞更容易附着，并促进细胞的分化、增殖，保持细胞的表型，但天然材料在生产、加工过程中，质量难以控制，性能发生变化。蚕丝已是天然成品可避免其它天然生物材料需进一步加工形成的缺点。蚕丝具有良好的表面活性和很好的组织相容性。所以蚕丝是软骨细胞立体培养的良好天然支架，其来源丰富，价格便宜处理简单，在软骨组织工程领域中将有广泛的应用前景。

    8  复合天然聚合物支架材料

    体内细胞生长的基质非常复杂，单一材料较难适应细胞培养的要求，通过共混调整不同材料之间的比例，使共混材料具有更适合细胞培养的力学性能、降解性和生物学性质等。天然可降解生物材料既可以与天然的生物材料共混，也可以与人工合成的生物材料共混。Yamane等用几丁质和硫酸软骨素混合制得水凝胶，在其中接种关节软骨细胞，发现细胞能很好地贴附于材料上，并且细胞能保持一些软骨细胞特殊的表型，如细胞呈圆形，存在有限的有丝分裂，能生成Ⅱ型胶原及蛋白聚糖等。这些结果证实硫酸软骨素-几丁质可能是一种很好的自体软骨移植载体材料或用于组织工程中类软骨组织的骨架［32］。透明质酸与藻酸盐、胶原蛋白或者几丁质混合包埋，将会对软骨细胞的吸附、增殖、分化产生更好的促进作用，最终导致特异性软骨基质形成［33］。天然高分子生物材料还可作为高分子聚合物的包埋剂以增强高分子材料的亲水性及对细胞的粘附、增殖、分化作用［34］。

    9  天然生物支架材料存在的问题和展望

    理想的软骨组织工程支架材料应具有以下特性：（1）具有良好的生物相容性。在体外培养时无细胞毒性，植入体内，无论其本身或其降解产物都应对机体无毒性，都不会导致机体炎症反应和引起宿主的移植排斥反应；（2）具有三维立体结构。必须是高度多孔的类似泡沫状，孔隙率应达到90％以上，并具有很大的内表面积，这样既有利于细胞的植入、粘附，又有利于细胞营养成分的渗入和代谢产物的排出；（3）具有良好的表面活性。应能够促进软骨组织粘附和增殖，并且能很好维持和促进软骨细胞的表型表达；（4）具有生物可降解性和降解率。支架在组织形成过程中应逐渐被降解，并且不影响新生成组织的结构和功能。材料支架的降解速率必须与种植入的细胞组织形成的速率相匹配，当材料支架完成为组织再生提供模板的功能后，可被完全地降解吸收掉；（5）具有可塑性。可被加工成所需要的形状并具有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状，并使新形成的组织具有符合设计的外形。

    天然生物支架材料来源于生物体本身，具有组织相容性较好，毒性较小，易降解，且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。但天然生物材料也存在一些需要解决的问题：(1)天然可降解的生物材料每批产品的质量都不一样，故其产品质量比较难控制。天然高分子材料在力学性能及降解速度、通透性等方面存在矛盾，即高分子量通常有高强度，但是它的降解速度和通透性就难以满足组织工程中细胞培养支架的要求。因此需要统一材料的质量标准，严格控制其质量，加强材料的性质和结构等基础理论的研究；(2)共混生物材料的研究开发，可以取长补短，来满足组织工程中不同组织的要求，生产出具有合适降解速度、良好通透性、弱免疫原性的细胞培养支架材料，所以应加强对共混膜的性质及制备方法的研究；(3)对现有天然生物材料，包括其衍生物也有待于进一步的研究开发，如对几丁质和透明质酸进行化学修饰，产生多种衍生物，使其更适合作为细胞培养的支架材料；(4)天然可降解生物材料与细胞之间的粘附问题也有待于进一步的研究，选择有利于细胞粘附的材料，同时可以对作为细胞培养支架材料进行表面修饰。

    总之，当前软骨组织工程支架材料研究重点是改进现有材料和制备工艺，并探索新材料和新的制备方法。在改进材料的基础上，将生长因子与支架复合或配以更合理的工程化细胞培养体系以提高软骨质量，并由动物实验逐步向临床应用过渡将是今后研究的方向，并将推动软组织工程研究向成熟阶段迈进。

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