大鼠神经干细胞缺氧后的内源性促红细胞生成素表达规律

     摘  要：［目的］观察神经干细胞缺氧后的内源性促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）表达规律，初步探讨缺氧预处理诱导神经保护作用的机制。［方法］测定大鼠神经干细胞缺氧培养4 h后不同时间的内源性EPO表达情况，以及预处理后不同时间，再次遭受致死剂量缺氧伤害后的EPO表达情况。［结果］缺氧时间为4 h，EPO蛋白在处理后即刻出现表达，4 h达高峰，8 h仍有部分表达。再次遭受致死剂量缺氧伤害后，与预处理4 h组相比，预处理24 h组细胞的EPO表达量明显增多。［结论］缺氧预处理能够提高神经干细胞应对伤害刺激时内源性EPO的表达，并降低再次缺氧时诱导EPO表达的阈值。

    关键词：缺氧；  预处理；  干细胞；  促红细胞生成素

    Expression of endogenous erythropoietin of rat neural stem cells after hypoxia∥SUN Chongyi,YAO Meng,CHEN Limin,et al.Department of Orthopeadics, 2nd affiliated hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086

    Abstract：［Objective］To investigate the endogenous erythropoietin expression of neural stem cells(NSCs) of rats after hypoxia.［Method］We used a rat NSCs culture model. EPO expression after 4 hours of hypoxia was studied. It was examined again following 12 hours of hypoxic lethal insult which was applied various times after hypoxic preconditioning. EPO expression was studied by western blotting.［Result］Following the preconditioning, expression of EPO increased immediately and reached a peak 4 hours later.It lasted till 8 hours later.While applied the lethal hypoxia,EPO expression of cells in preconditioning 24 hours group were was significantly increased than that in preconditioning 4 hours group.［Conclusion］The hypoxic preconditioning can lead an increased endogenous EPO expression and decrease the threshold of EPO expression against subsequent lethal stimulation during a certain period.

    Key words：Hypoxia;  Preconditioning;  Stem cells;  Erythropoietin

   脊髓损伤是一种致残率很高的疾病。神经功能恢复多不理想。神经干细胞是一类具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞，体外培养的神经干细胞移植治疗脊髓损伤成为近年来研究的热点之一。但细胞绝对数量和移植后局部微环境所限，使移植后细胞存活率不高［1］，限制了其神经功能修复作用，影响移植效果。最近研究表明，短时间缺氧处理可以有效提高各种组织应对伤害性刺激的能力，称之为缺氧预处理。本研究通过体外实验，探讨大鼠神经干细胞缺氧处理后内源性促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）表达的规律，以期为神经干细胞缺氧预处理理论提供依据。

    1  材料与方法

    11  实验材料

    111  实验动物

    孕13天的SD（SpragueDawley）大鼠，由哈医大二院动物中心提供。

    112  主要试剂  DMEM/ F12 (1∶1) （Gibco）；B27（Gibco）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和表皮生长因子(EGF)（Pepro Tech）；AntiNestin兔抗多克隆抗体 (武汉博士德)；AntiEPO兔抗多克隆抗体 (武汉博士德)；SP羊抗兔二抗试剂盒及DAB显色盒(北京中杉)。

    12  实验方法

    121  原代神经干细胞的分离、培养  取孕13 d的SD大鼠脱颈椎处死，无菌条件下取出胎鼠大脑半球，冰浴下剥离脑膜及血管，将脑组织尽量剪碎，滤液离心（900 r／min，5 min），弃去上清液， 加入含20 μg/L EGF、125 μg/L bFGF和2％B27的DMEM/F12（1∶1）培养液中，吹散细胞后吸出，接种于培养瓶中培养，调整细胞密度至1×105／ml。2～3 d半量换液。

    122  神经干细胞的鉴定  行Nestin免疫组化，抗体工作浓度为1∶100，以PBS代替一抗作阴性对照。

    123  缺氧预处理条件的应用  无菌条件下,将95%N2＋5% CO2的气体通入DMEM/F12培养基中5 min，置换培养基及培养瓶中的氧气，神经干细胞用此培养基全量换液后，移入37 ℃，PO2为0条件的培养箱内培养预定时间。以4 h为缺氧预处理条件，12 h为致死性缺氧处理条件。

    124  神经干细胞缺氧处理后的EPO蛋白表达  以缺氧4 h为处理条件，检测处理后不同时间EPO蛋白的表达。缺氧预处理后，分别继续常规培养4、24 h，给与致死性缺氧12 h处理，于处理后即刻、4 h检测EPO蛋白的表达。未经预处理的细胞做对照组。

    检测方法采用Western blot法，将待检测细胞用磷酸盐缓冲液(PBS) 漂洗后，裂解缓冲液,作用30 min 后离心。凝胶电泳分离,转膜后, TTBS封闭。加入兔抗大鼠EPO抗体,4 ℃孵育过夜,漂洗后加入相应的特异性HRP二抗,37 ℃作用60 min ,洗膜后ECL试剂盒显色。以βactin做内参照，用Total Lab v 201软件定量检测蛋白表达。

    13  统计学处理

    数据用SPSS 100软件分析，t检验，P<001时有统计学意义。

    2  结  果

    21  细胞培养

    原代取材，镜下观察可见大量细胞，胞体光滑圆润，胞质透亮，折光性强。24 h内细胞开始聚集、分裂；5～7 d时，细胞聚集生长呈神经球，悬浮生长。对所获神经球检测显示，球内几乎所有的细胞都呈Nestin阳性，说明培养所获得的神经球为神经干细胞球。

    22  神经干细胞缺氧处理后的EPO表达

    Western blot法显示，未经缺氧处理，NSCs几乎无EPO表达；EPO蛋白的表达于处理后即刻开始出现，4 h最为明显，8 h仍有少量表达（图1）。 图1  缺氧预处理后不同时间EPO的表达  1对照组（无缺氧）；2预处理后即刻；3预处理后2 h；4预处理后4 h；5预处理后6 h；6预处理后8 h致死性缺氧处理后，各组细胞EPO的表达见图2，经Total Lab软件处理后的蛋白表达相对光密度值见图3。致死性缺氧处理后1 h，预处理4 h组和24 h组的EPO蛋白表达相对光密度值均明显高于对照组，4 h组和24 h组之间无统计学差异。致死性缺氧处理后4 h，对照组相对光密度较处理后1 h下降；预处理4 h组相对光密度较处理后1 h有所增加，但无统计学意义；预处理24 h组相对光密度较处理后1小时明显增加，统计学处理，P<001，说明该组细胞再次经受致死性缺氧处理后4 h，其EPO蛋白表达明显增多。 图2  致死剂量缺氧处理后各组细胞EPO的表达  LH：致死剂量组  LH4：致死剂量后4 h组  PH4LH：预处理后4 h加致死剂量组 PH4LH4：预处理后4 h加致死剂量后4 h组  PH24LH：预处理后24 h加致死剂量组  PH24LH4：预处理后24 h加致死剂量后4 h组  图3  缺氧预处理对大鼠神经干细胞EPO表达相对光密度值的影响  1LH  2LH4  3PH4LH  4PH4LH4  5PH24LH  6PH24LH4  ☆P<001  △P>001

    3  讨  论

    脊髓损伤后的神经功能修复一直是困扰临床医师的难题之一。长期以来认为，成年哺乳动物中枢神经系统是不可能再生的，即神经元是终末细胞，不能通过分裂增殖产生新神经元以替换死亡的神经元。因此，脊髓损伤的治疗更多着眼于继发性损伤的处理，神经组织受损导致的功能丧失成为不可逆的过程。神经干细胞的发现为神经系统损伤的修复提供了重要的途径，成为近年来的研究热点［2］，这一发现改变了神经系统损伤后不能“再生”的传统概念。由于干细胞的多潜能分化特性，体外培养、扩增的神经干细胞重新移植至体内，他们不但能生长、存活，而且能迁移分化并发挥功能。这些过程是受局部环境中的特异性信号调控［3］，同时受到移植区局部环境内各种有害因素的影响［4］，使得存活的神经干细胞比例过低。细胞密度低于一定水平时，细胞间各种因子、分子的浓度就达不到神经干细胞生长的要求，从而又进一步不利于其生长分化，形成恶性循环，这也正是影响移植效果的重要原因［1］。因此，提高植入的神经干细胞抵御周围伤害性因素的影响，提高存活率，是取得移植成功的关键之一。

    近年来，有学者提出了“预处理”的概念，这是细胞的一种内源性保护机制，是指亚致死性伤害性刺激作为预处理，可以对继之而来的致死性伤害提供一种保护作用。国内外的大量研究表明，这一保护性机制广泛存在于器官、组织、细胞水平，在神经系统内也有发生［5］。因此，作者可以大胆地假设，这种预处理效应对体外培养的神经干细胞同样存在。缺氧是细胞移植后最普遍的伤害刺激之一，因此，作者将缺氧作为刺激条件。而且相对于一些在体研究，在移植前进行离体细胞预处理，可以更有效保证受体的安全，使这项技术具有可操作性。

    许多学者认为，机体组织缺氧后会提高缺氧诱导因子（HIF）1α亚型的表达，HIF1α通过作用其下游靶基因介导了缺氧后的一系列病理生理变化，而EPO基因正是HIF1α最为重要的下游基因之一。 EPO是一种调节红细胞生成的糖蛋白，近年来的研究表明，它同时还具有内源性的神经保护作用，可应用于各种神经组织损伤的治疗。在各类神经组织的缺氧预处理过程中，EPO也发挥了重要的作用，如神经元［6］、视网膜［7］等。有关神经干细胞缺氧预处理的研究虽无报道，但Tetsuro［8］证实，一定强度的缺氧可以促进体外培养神经干细胞EPO mRNA产物的增多以及细胞增殖。

    本实验通过Western Blot法，在蛋白水平上进一步证实了神经干细胞缺氧后EPO表达的变化。EPO蛋白的表达于缺氧后即刻开始出现， 4 h最为明显，持续约8 h，和Tetsuro等在EPO基因水平上得出的结论基本一致［8］。但同时也说明预处理剂量的缺氧尚不足以诱导细胞产生持久稳定的EPO浓度。但再次经受致死剂量的缺氧后，预处理后24 h的神经干细胞的EPO表达明显多于其它组细胞。因此，我们有理由认为，缺氧预处理可以提高神经干细胞再次遭受致死剂量缺氧时的内源性保护能力，其原因不完全是因为预处理提高了细胞本身EPO的表达量，更重要的是降低了再次应激时诱导EPO表达的阈值。这种阈值的降低出现在预处理后24 h，而不是4 h，说明神经保护作用需要一个诱导过程，诱导时间和持续时间在体外和体内实验中都是不同的，同时和实验用动物的种属差异也有关系。另一个值得提出的问题是，这种保护作用具有普遍性。Eisen等［9］认为，缺氧预处理不仅仅针对进一步的缺氧损伤，而对于其他形式的伤害方式也同样具有保护作用。这体现了缺氧预处理的广泛性和非特异性，使其更具有应用价值。有关大鼠神经干细胞缺氧预处理的动物体内实验数据尚需进一步的研究。

    参考文献：

    ［1］  Rossi F,Cattaneo E.Opinion: neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality［J］.Nat Rev Neurosci, 2002,3(5):401-409.

    ［2］  马云青,罗卓荆. 脊髓神经干细胞的研究进展及应用前景［J］. 中国矫形外科杂志, 2005(04).

    ［3］  Zhu G,Mehler MF, Mabie PC, et al. Developmental changes in neural progenitor cell lineage commitment do not depend on epidermal growth factor receptor signaling［J］. J Neurosci Res, 2000,59(3):312-320.

    ［4］  Fishell G.Striatal precursors adopt cortical identities in response to local cues［J］. Development, 1995,121(3):803-812.

    ［5］  Prass K, Scharff A, Ruscher K, et al. Hypoxiainduced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin［J］. Stroke, 2003,34(8):1981-1986.

    ［6］  Liu J,Narasimhan P, Yu F, et al. Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves oxidative stressmediated expression of hypoxia-inducible factor and erythropoietin［J］. Stroke,2005,36(6):1264-1269.

    ［7］  Grimm C,Hermann DM, Bogdanova A,et al. Neuroprotection by hypoxic preconditioning: HIF1 and erythropoietin protect from retinal degeneration［J］. Semin Cell Dev Biol, 2005,16(4-5):531-538.

    ［8］  Shingo T,Sorokan ST, Shimazaki T,et al.Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cells［J］. J Neurosci, 2001,21(24):9733-9443.

    ［9］  Eisen A,Fisman EZ,Rubenfire M, et al.Ischemic preconditioning:nearly two decades of research.A comprehensive review［J］. Atherosclerosis, 2004,172(2):201-210.

     （哈尔滨医科大学附属二院骨科，哈尔滨市  150086）