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摘 要：
［目的］探讨梯度降解软骨支架材料(GDABM)的细胞生物相容性及诱导后的骨髓基质干细胞(MSCs)在三维支架上培养的生物学行为。［方法］将 MSCs与复合转化生长因子-β(TGFβ)的胶原共同混合后培养于三维软骨支架材料上，离心管内培养，10次／d，以600 r／min离心10 min。8 h、24 h、72 h、 4 d、7 d进行倒置显微镜形态学观察、扫描电镜观察。1～8 d采用MTT法检测细胞增殖活性，描绘生长曲线。通过3HProline掺入实验了解材料对MSCs胶原合成的影响。［结果］8 h后MSCs在支架材料上呈球型黏附生长，4 d后MSCs在支架材料上呈菱形或多角型复层生长，包裹于大量细胞外基质内。GDABM组细胞第3 d进入对数增长期，倍增时间为475 d，而单纯软骨细胞培养对照组倍增时间为525 d。GDABM组与单纯软骨细胞培养对照组比较胶原合成略低，３HProline掺入值有显著性差异(P<005)，说明经诱导MSCs的细胞胶原分泌功能仍低于软骨细胞。［结论］经TGFβ诱导和低转速离心应力刺激后的MSCs向软骨细胞功能分化，复合细胞因子梯度降解软骨支架材料具有良好的生物相容性，可作为MSCs的有效载体应用于组织工程化软骨的构建。
关键词：基质干细胞； 生物材料； 生物相容性； 组织工程
中图分类号 R687
Experimental studies on gradient degradation cartilage biomaterials combined with cultured marrow stroma cell in vitro
QU Yanlong, YANG Weiliang,MENG Xiangwen, et al.
Department of Orthopedic Surgery, the First Clinical Hospital, Harbin Medical University, Harbin150001, China
Abstract：［Objective］To study the biocompatibility of gradient degradation cartilage biomaterials (GDABM) and biological behavior of cultured marrow stroma cell(MSCs) combined with this threedimension scaffold in tissue engineering. ［Method］MSCs(5×106) were cultured combining with GDABM in vitro in centrifuge tube, TGFβ was added to collagen and attached to GDABM. Culture tube was centrifuged in 600 r/min, 10 times/d, 10min per time. The morphological characters, cell proliferation were detected. Collagen synthesis were tracked by incorporated radioactive 3H labeled proline into culture. ［Result］The MSCs attached to GDABM and grew along fibers in lozengelike or multiangularlike manner Cells in GDABM group reached logarithm increasing period at the third day. Its' doubling time was 4.75 d, While cells in control group was 5.25 d. There was difference of 3HProline value between the' two groups(P>0.05),which hint that the MSCs function was induced to cartilage in collagen synthesis, but MSCs collagen function level was lower than that of cartilage. ［Conclusion］MSCs can be induced to cartilagecollagen function cell in low centrifuge stress combined with TGFβ. GDABM show good biocompatibility combined with MSCs and can provide a promising extracellular matrix scaffold for cell transplantation in cartilage tissue engineering.
Key words: Marrow stroma cell; Biomaterials; Biocompatibility; Tissue engineering
软骨损伤退变造成的缺损修复仍是临床难题。国内外学者曾尝试同种异体或自体软骨移植等方法修复缺损，但存在排斥反应和供区功能缺失的问题。组织工程的兴起为软骨损伤的修复提供了全新的思路和方法［1］。作者选择梯度降解软骨支架材料(gradient degradation cartilage biomaterials，GDABM)与骨髓基质干细胞体外培养，研究软骨支架材料的生物相容性、MSCs在三维支架材料上的生物学行为。
1 材料与方法
11 材料
梯度降解软骨支架材料采用医用可吸收高分子聚合物：聚酯聚二氧杂环已烷(polydioxanone，PDS)、聚已酸内酯(polycarpolaction，PCL)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(polyDLlactidecoglcoliide 85／15,PLGA)，PCL∶PDS∶PLGA=1∶1∶1。聚合物纤维制成无纺布，纤维间距80 μm。各组份梯度降解高峰时间：PDS 4周，PLGA 8周，PCL 12周。包装后γ射线消毒备用。
12 方法
121 MSCs的分离培养
新西兰幼兔，雌雄不限，无菌条件下截取双下肢长骨，剪除长骨干骺端，注射器吸取DMEM／F12培养液(Sigma，1∶1)冲洗骨髓腔，获取骨髓液，加等量淋巴细胞分离液梯度离心(2 500 r／min，15 min)，吸取富含粒细胞层，即MSCs层，含10％胎牛血清DMEM／F12培养液中培养，原代细胞贴壁、融合成单层细胞后传代培养。
122 软骨细胞的分离培养
取新西兰幼兔肋软骨剪切成碎块，02％胰蛋白酶30 min,02％Ⅱ型胶原酶消化液60 min依次消化。含10％胎牛血清DMEM／F12培养液培养，加入胶原及TGFβ(10 ng／ml)后原代培养作为对照组。
123 MSCs与支架材料复合培养
在胶原中加入TGFβ(10 ng／ml)后与MSCs混合，调节接种密度为5×10６个细胞／ml，与支架材料在离心培养管中复合培养，8 h后给予离心应力(600 r／min，离心10 min)刺激，10次／d。
13 观察及检测
131 倒置相差显微镜观察
MSCs接种于材料后8 h、24 h、72 h、7 d、2个月使用相差显微镜观察MSCs黏附、生长、增殖情况。
132 扫描电镜观察
分别于24 h、72 h、7 d将复合MSCs的梯度降解软骨支架材料取出，3％戊二醛固定，系列脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后在AMRAY(U.S.)扫描电子显微镜下观察。
133 MTT法分析MSCs与支架材料复合培养后的存活和增殖能力
按上述方法将MSCs与材料复合，在离心管培养，检测时置入24孔培养板，每组设5复孔，分别于1～8 d终止培养。设置单纯软骨细胞培养对照组。终止培养前4 h每孔加入MTT(Sigma 5g／1)50 μl，37 ℃孵育4 h。弃上清液，每孔加入二甲基亚砜1 ml振荡10 min，在BioAssay Reader(PERKlN ELMER，U.S.)上选择波长490 nm读取A值，描绘生长曲线。
134 ３HProline掺入实验检测胶原合成能力
将实验与对照组细胞同上处理。48 h后每孔加入06 ml含37kBq HProline的培养液，置37 ℃恒温孵箱中过夜。结束培养后收集各孔上清液，用闪烁仪测定样品中每分钟射线脉冲数(cpm)。
14 统计学方法
采用SPSS 100软件包进行方差分析，P<005为有显著性差异，P<001为有极显著性差异。
2 结 果
21 倒置相差显微镜观察
单纯软骨细胞培养软骨细胞48 h后贴壁，呈多角型，7 d后细胞逐渐融合成单层，呈铺路石样外观，传代至5代后细胞呈长梭形纤维细胞样外观，出现去分化现象。MSCs细胞原代培养24 h后贴壁，呈大多角型(图1)，72 h后细胞开始增殖，形成3～6个细胞的细胞团。细胞不断增殖，新生的细胞呈圆形，位于中心，周围的细胞逐渐变为菱形或梭形(图2)。将此细胞与支架材料复合培养，12 h细胞呈球形黏附于三维纤维支架上，晃动易脱落；24 h细胞呈菱形黏附包裹于三维纤维支架上；72 h细胞围绕支架纤维呈复层生长并分泌透明细胞外基质，包裹三维支架纤维；7 d细胞增殖减缓，细胞及细胞外基质填充和包裹整个三维纤维支架，细胞与支架材料复合体透光度降低，呈胶冻状(图3)。
22 扫描电镜观察
扫描电镜下24 h MSCs呈菱形和多角型黏附于支架材料间，细胞表面有颗粒状突起，有胶原样细胞外基质包裹MSCs。72 h支架纤维被薄层细胞外基质包裹，MSCs细胞山丝样结构黏附在纤维支架上。7 d后细胞和细胞外基质填充、包裹整个三维纤维支架，MSCs被大量胶原样物质覆盖(图4)。
23 MSCs与软骨细胞增殖测定
生长曲线上可见，GDABM组细胞第3 d进入对数增长期，倍增时间为475 d，单纯培养对照组倍增时间为525 d。GDABM上MSCs细胞增殖快、倍增时间短，且增殖峰值高于单纯软骨培养对照组，6 d后进入平顶期(图5)。
24 ３HProline掺入实验检测胶原合成能力
支架材料复合MSCs细胞组３HProline掺入值低于单纯软骨培养组，两者比较有显著性差异(P<005)（表1）。
表1 ３HProline掺入法检测梯度降解软骨支架材料对MSCs细胞胶原合成的影响（略）
图1 MSCs细胞原代培养24 h后贴壁，呈大多角型，部分细胞折光性强(倒置显微镜×100)（略）
图2 72h后MSCs细胞开始增殖，形成3～6个细胞的细胞团。细胞不断增殖，新生的细胞呈圆形，位于中心，周围的细胞逐渐变为菱形或梭形(倒置显微镜×200) （略）
图3 MSCs与GDABM支架材料复合培养7 d细胞增殖减缓，细胞及细胞外基质填充和包裹整个三维纤维支架，细胞与支架材料复合体透光度降低，呈胶冻状(倒置显微镜×100) （略）
图4 7 d MSCs呈菱形和多角型黏附于支架材料间，细胞和细胞外基质填充、包裹整个三维纤维支架，MSCs被大量胶原样物质覆盖(扫描电镜×2800)（略）
图５（略）
3 讨 论
软骨支架材料研究是软骨组织工程研究的重点，以往材料采用单一可吸收生物材料，降解过程中力学强度、失重率、分子量的下降为非线形关系，即高分子可吸收材料在材料降解过程中存在特定时段的降解加速过程，此过程将使力学强度发生较大变化［2］，组织工程软骨支架强度将急剧下降，支架塌陷。本实验选用3种可降解材料复合成支架材料，复合MSCs细胞体外培养。3种成分不同时段降解，既为修复后的软骨提供足够生物力学强度，又能通过逐步降解为软骨细胞增殖及胶原合成提供空间，配合新生软骨形成。MSCs细胞具有多向分化潜能，可向软骨细胞转化［3］，这将使组织工程软骨通过自体骨髓细胞体外构建成为可能。从而避免了供区软骨缺失或同种异体软骨移植产生的免疫排斥反应［4］。通过形态学观察，MSCs细胞在支架材料上呈菱形形态，可在支架材料中三维立体生 长，增殖旺盛并分泌大量胶原等细胞外基质填充包裹整个支架材料。采用放射性同位素３H标记脯氨酸掺入培养液来追踪MSCs细胞及软骨细胞胶原的合成，实验结果显示，与支架材料复合培养的MSCs细胞合成分泌胶原功能与单纯软骨培养比较，胶原基质合成低于单纯软骨细胞。生长曲线表明MSCs细胞在增殖方面强于单纯软骨细胞，提示MSCs适于体外培养扩增，可用于组织工程种子细胞的构建。与静力状态下培养不同，模拟体内微环境给予MSCs细胞离心压应力、剪切应力刺激、细胞因子等作用能够加速细胞的生长繁殖、胶原合成和胶原塑形能力。但如何模拟体内应力环境及复杂的细胞因子协同或序惯作用将是今后软骨修复研究的方向。
参考文献：
［1］ 杨志明.组织工程基础与临床［M］.成都:四川科学技术出版社，2000，201-213.
［2］ Lichun L,Susan J,Michelle D, et al. Invitro degradation of porous poly(Llactic acid) foams［J］. Biomaterials,2000,21:1595-1605.
［3］ Prokop, DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues［J］. Science,1997,276:71-74.
［4］ 李松军，安荣泽，谢伟.TGFβ1和bFGFs体外诱导成人骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的实验研究［J］.中国矫形外科杂志,2005，13(8):608-611.
(哈尔滨医科大学附属第一临床医院骨科， 哈尔滨 150001)
基金项目：黑龙江省教育厅基金项目(10541121)