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缺血性脑血管疾病是严重危害人类健康的常见病和多发病，其发病率和死亡率在国内外均居前位，因此对缺血性脑损伤的研究具有重要的现实意义。如今，通过干细胞来治疗缺血性脑损伤的研究已取得令人振奋的成果。研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）或称为骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）也具有干细胞特性，有多向分化的潜能［1］，不仅可以分化为中胚层的各种细胞而且经诱导能向神经外胚层分化［2，3］。MSCs移植具有以下优点：可以作为自体移植，避免了免疫排斥和移植物抗宿主反应；能通过静脉应用，并发症最少［4］；同时细胞来源比较充足，不存在伦理道德上的争议，因此，是一种理想的组织工程干细胞。
1 MSCs分类及生物学特性
1867年德国病理学家Cohnhien首次提出骨髓中除造血干细胞外，还存在非造血干细胞——间充质干细胞（MSCs），又称骨髓基质细胞或成纤维祖细胞集落（colonyforming units-fibroblastic,CFUF-F）。20世纪70年代，Friedenstein等［5］首次报道骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养的过程中能够分化出类似骨、软骨的集落。后来证实这些集落就是MSCs。现在普遍认为MSCs主要有3类细胞组成，即小的梭形细胞、较大而扁平的成熟细胞以及自我更新速度快但极小的圆形细胞，它较其他细胞有更强的多向分化潜能。
近年来，有关MSCs的生物学特性的研究得到了进一步的深入，这为研究MSCs移植治疗神经系统疾病提供了保证：（1）MSCs具有良好的自我更新能力和在体外扩增速度。Colter等［6］将人的MSCs以3个细胞/cm2的密度接种，培养10天后，细胞大约扩增了2000倍，其倍增时间约为12h。（2）可塑性和多分化潜能。现普遍认为可塑性是MSCs的重要特性，并且可塑性可能一直保持到分化的最后阶段。在体外适合条件下MSCs可分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞以及神经细胞［7］。（3）迁移能力。移植后的骨髓基质细胞具有迁移能力且受病变部位信号的影响，可源源不断地进入广泛区域［8］。（4）低免疫性和良好的组织融合性。MSCs来自中胚层的早期细胞，免疫性弱，不使用免疫抑制剂进行移植仍可取得满意疗效。可能的机制是骨髓基质细胞分泌可溶性的介质下调异体移植的免疫反应［9］。Martin也认为，在异体移植骨髓基质细胞没有必要进行免疫抑制治疗［10］。
2 MSCs的分离与鉴定
2.1 分离
从骨髓中分离MSCs的方法主要有：根据骨髓MSCs的黏附特性来实现分离的贴壁筛选法；根据MSCs与其他细胞的密度不同来分离的密度梯度离心法；根据细胞大小不同或表面的一些特殊标志来分离的流式细胞仪分选法和免疫磁珠法等。现广泛采用贴壁筛选法分离MSCs。
2.2 鉴定
目前尚未发现MSCs有特异的表面标记物，研究表明［11］MSCs对SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90和CD124均呈阳性反应，而不表达CD34、CD14和CD45等造血干细胞表面标记物。因此，利用这些表面标志和细胞形态可初步鉴定MSCs。
3 MSCs移植治疗缺血性脑损伤的可行性及途径
3.1 MSCS移植治疗缺血性脑损伤的可行性
1992年，Haynesworth等［12］首次分离出人类骨髓干细胞（marrow stem cell,MSC）并证实有多种分化潜能，可以分化成为成骨细胞、软骨细胞等。近几年人们利用不同的诱导剂和在不同的体内、外环境下已分别诱导分化出各种神经细胞。1995年，Lazaras等［13］将体外培养的MSCs输入成年癌症病人体内，开始了MSCs治疗相关疾病的新时代。Kopen等［14］将MSCs注入新生的小鼠侧脑室，MSCs存活，经小鼠的前脑和小脑，到达宿主的大脑内，而不破坏宿主的脑内结构。其中一些MSCs在纹状体和海马内分化为表达星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（glia-fibrillary acidic protein,GFAP）的成熟星形细胞，另有大量MSCs在小脑外颗粒层，而且在脑干网状区有部分MSCs分化为表达神经元标志蛋白神经微丝（neurofilament,NF）的神经元。Li等［15］在成年大鼠暂时性大脑中动脉闭塞模型中，将MSCs植入大鼠缺血半暗带区的纹状体和皮质，发现MSCs在缺血性脑损伤区存在活跃的代谢改变，并可改善成年鼠因脑卒中引起的神经缺失。Zhao等［16］将人的MSC移植入大鼠脑梗死1周后灶周的皮质中，2～6周后肢体感觉运动功能明显提高。Mahmood等［17］将体外培养的经5-溴脱氧尿苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU）标记的大鼠MSCs经尾静脉移植到外伤性脑损伤（traumatic brain in jury,TBI）的雌性大鼠模型中，检测移植后MSCs体内分化以及使用旋转运动测试（rotarod test）和神经系统疾病严重程度评分（neurological severity score,NSS）来评估大鼠的神经功能。移植后在大鼠脑组织发现标记的MSCs，其中部分细胞表达神经元标记物神经元特异性核蛋白（neuron specific nuclear protein,NeuN），还有部分细胞表达神经胶质细胞的特异性标志物GFAP，表明MSCs在体内能够分化为神经元和神经胶质细胞。同时MSCs移植组的大鼠的运动功能和神经功能缺损与对照组相比有明显的改善。Lu等［18］将以BrdU标记的MSCs经颈内动脉注射移植到TBI模型的大鼠体内，发现BrdU阳性细胞能迁移至脑内，在损伤灶的边缘、胼胝体和大脑半球有细胞的聚集。免疫组化染色显示部分细胞表达NeuN和GFAP，同时大鼠的神经功能障碍也有明显改善。胡德志等［19］经枕大池将以BrdU标记的MSCs移植到TBI模型大鼠的蛛网膜下腔，3周后发现标记的MSCs进入皮质下的最大距离为3mm，双标记染色可见部分BrdU阳性细胞呈现GFAP或微管相关蛋白-2（microtubule-associated protein 2,MAP-2）染色阳性。
上述结果表明，MSCs通过各种途径移植到脑内均可分化为神经元和星形胶质细胞，为MSCs移植治疗缺血性脑损伤提供了强有力的证据。
3.2 MSCs移植治疗缺血性脑损伤的途径
3.2.1 通过立体定向或开颅直接注射入损伤部位
该方法优点是可将MSCs直接送达缺血部位，提高移植物抵达靶点的数量。缺点是对脑组织产生一定的损伤；移植物的数量受一定程度的限制；不便多次多靶点注射。
3.2.2 经静脉注射移植
该方法简便、安全、快捷、有效，一次可输入较大数量的MSCs，而且进入脑内的MSCs分布在缺血坏死灶及周边区较大的范围内。但需要通过血脑屏障以及血浆成分可能对其产生影响。
3.2.3 经颈内动脉注射移植
此方法的优点是移植的MSCs可广泛分布于缺血中心及半暗带地区；创伤较小，危险性低；可允许较多数量、较大体积的移植物输入；有更多的移植细胞在缺血区存活。缺点是需要一定的技术条件。
3.2.4 直接注射入脑室、脑池或腰穿注射入蛛网膜下腔
直接移植入脑脊液，部分避开了血脑屏障，但有无菌性蛛网膜炎和蛛网膜下腔粘连的危险。
4 治疗脑缺血损伤的机制
尽管MSCs移植对脑缺血损伤功能改善的作用已得到公认，但其治疗的机制目前还存在争议。
4.1 重建神经环路
MSCs在脑内特化成神经细胞组织，替代损伤的细胞，重建神经环路。2000年，Brazeton等［20］将表达绿色荧光蛋白（GFP）的成年小鼠MSCs经尾静脉注入经致死量照射的同基因成年小鼠体内，发现在嗅球、海马、皮质和小脑等部位有GFP（+）细胞，这些细胞表达NeuN、NF等神经元标志蛋白，表明植入的MSCs可分化成神经细胞而发挥作用。Kopen等［8］的实验也表明了这一点。
4.2 提供营养支持
移植的MSCs细胞在脑内激活内源性修复反应或分泌神经因子给宿主细胞提供营养支持。Zhang等［21］则认为，移植的MSCs主要是通过刺激产生内源性因子而实现功能修复的。尽管一些移植后的MSCs源性细胞表达典型的神经细胞标志，但MSCs分化来的细胞替代了坏死的细胞而带来的功能修复的可能性是微乎其微的，这些学者认为修复是由于MSCs激活了损伤脑的内源性的修复反应，包括血管发生、神经发生、突触生成、神经重组等。Mattson等［22］对大脑皮层局灶性缺血模型进行脑细胞移植，发现从宿主细胞到移植细胞之间有广泛的传入神经支配，而移植细胞之间以及移植细胞到宿主细胞之间的传出神经连接却非常少，这提示：实验动物行为学的改善是由于移植的干细胞给宿主细胞提供营养支持的结果。
4.3 促进缺血区新血管的形成
骨髓细胞中包含有血管内皮细胞，缺血性损伤能刺激血管内皮祖细胞从骨髓中被动员到外周血中，归巢、汇集到缺血组织中，分化成内皮细胞，形成新血管［23］。新近的研究已证明，骨髓源性细胞参与了缺血性脑损伤的新血管形成［24］。Chen等［21］以人MSCs静脉移植到大脑中动脉阻塞模型的小鼠，发现能诱导提高鼠内源性血管内皮生长因子及其受体水平，并促进缺血区的新血管形成。
4.4 内源性神经干细胞的作用
自体脑内的神经干细胞在脑损伤后可能也发挥着积极的作用。Cao等［25］认为内源的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）可针对微环境的变化调整增殖与分化的速度，而且这种潜力不限于正在进行神经组织生成的区域。Chen等［26］标记了鼠脑室管膜下区的有丝分裂活跃的细胞，发现脑损伤后细胞数增加了数倍，同时还表达神经元和胶质细胞的标志，少数内源性神经干细胞分化成的新神经元能建立突触联系，但无长距离的投射性突触，功能上类似于成熟的颗粒细胞，而且其功能与特定脑区的功能是相关的。
此外，Vallieres等［27］则认为从骨髓提取的MSCs中就已经混有了神经干细胞，它们可能来自营养骨的外周神经，是这些细胞在MSCs移植后分化出表达神经细胞标志的细胞MSCs，而不是MSCs分化的。
5 问题与展望
MSCs移植应用于治疗缺血性脑损伤的研究尚处探索阶段，有待解决的问题还很多，例如是什么分子信号诱导骨髓间质干细胞向损伤区域迁移，使骨髓间质干细胞更准确地位置锚靠及分化；MSCs在脑内存活的机制、影响因素以及在损伤恢复中的地位；细胞移植后是否产生动作电位，能否整合入宿主的神经环路，与其他细胞产生突触联系进而分泌神经递质；用纯化的MSCs进行移植还是将MSCs连同细胞外基质一同移植；MSCs移植时间与脑缺血临床症状恢复之间是否存在时间窗。MSCs移植治疗脑损伤虽然是很有潜力的治疗方法，试验研究已确证有明显疗效，但似乎更应强调一种移植综合治疗的思路，即将MSCs移植与基因治疗联合进行，也可将多种干细胞混合移植。Irving等预测，在未来的20年中，干细胞移植将以造血干细胞和组织特异的干细胞或祖细胞一同移植为主［28］。
总而言之，MSCs移植用于治疗缺血性脑损伤后的神经功能损伤有广阔的前景。
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作者单位： 121001 辽宁锦州，锦州医学院第一附属医院神经外科
（编辑：宋青）