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【摘要】 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一种具有跨胚层分化潜能的干细胞。近年来研究发现其可在中枢神经系统内存活并能分化为神经样细胞,在体外也可通过诱导向神经细胞转化,并对脑缺血、脑外伤等疾病的神经功能的缺损有改善作用。其取材方便、体外扩增迅速且能以多种途径移植包括静脉移植、脑内移植。故骨髓间充质干细胞在中枢神经系统损伤修复中的临床应用前景广阔。
【关键词】 骨髓间充质干细胞；脑缺血；移植
【Abstract】 Mesenchymal stem cells (MSCs) are stem cells that lying in marrow .The research showed that the cells could survive and were induced to divide so as to be confirmed as neural stem cells (NSCs) in vivo and ex vivo as so. It could be used to replace the neural cells or repair the nervous system,such as ischemic stroke, brain injury and so on. MSCs was easly grained and cultured,and there were various method of such as vein transplantation,directed transplantation. It provides a hopeful method for central nervous system diseases.
【Key words】 mesenchymal stem cells;ischemic attack;transplantation
脑血管疾病（cerebrovascular disease,CVD）是由于各种脑血管病变所引起的脑部病变。其中以缺血性脑血管病为主，其发病率、致残率、死亡率随年龄增长而增长，因病因、发病机制复杂，所采取的干预措施如早期溶栓等仍存在着局限性，使缺血性脑血管病的治疗状况得到根本改善的相关研究仍待进一步深入。自1992年Reynolds和Weiss从成年鼠海马分离出神经干细胞（neural stem cells，NSCs），打破了传统观点认为在成年中枢神经系统（central nervous system，CNS）中大多数神经元己不能分化，一生中至死不会更替的概念。1999年Elizaberth在Science杂志上报道了成年恒河猴脑的新皮层中有发育成新生的神经元，继后，Ｅriksson医生在癌症病人脑内证实了人类成体脑中新生的神经元，认识到成人脑组织也有自我更新能力。Kempermann等认为可逆性是脑的一个基本特征，即使中老年人大脑也具有可塑性，通过干预神经系统细胞使之特异分化而获取神经元，以便进行脑功能的修复，这对缺血性脑血管病的治疗有了突破性的进展。骨髓间充质干细胞（mesencgymal stem cells，MSCs）是继胚胎干细胞后备受关注的来源于骨髓的细胞群，由于这些细胞易于在塑料瓶皿表面贴壁生长形成纤维细胞样集群，曾被称为贴附塑料细胞，后又因其存于骨髓基质而称为骨髓间充质干细胞。MSCs具有多向分化潜能，特性稳定，能向脂肪母细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等［1~3］分化。目前，研究表明MSCs免疫原性较弱，能直接或间接抑制T细胞的功能，使MSCs可应用于同种异体或异体移植，拓宽了临床治疗的前景。
1 骨髓间充质干细胞的特点
1.1 定义 骨髓间充质干细胞(MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中也可分离得到。具有向骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、神经细胞、干细胞、脂肪细胞和造血细胞等分化的能力。同所有的干细胞一样，骨髓间充质干细胞也具有自我更新能力和多向分化潜能。它虽然仅占骨髓单核细胞的0.001％~0.01％，但是却具有惊人的增殖能力。
1.2 骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定
1．2．1 骨髓间充质干细胞的体外培养 1970年，Friedenstein等［4］，将含全骨髓组织用塑料培养基培养，4h后弃去未贴壁细胞，经过3~4天的休眠后迅速增殖，培养数代后形态趋于一致，呈纺锤状。并发现在塑料培养基上，骨髓基质细胞可逐渐分化为骨、软骨。提示在体内可能具有同样的分化功能。Kohyama等［5］首次报道使用5-氮杂胞苷（5-AZa-c）和Noggin作为诱导剂，使MSCs可分化为功能成熟的神经细胞。Sanchez-Ramos等［6］将骨髓基质细胞培养在含有EGF和脑源性神经营养因子（BDNF）的培养液中，检测到巢蛋白（nestin）及其RNA的表达，也表达星形胶质细胞标记的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）；与胚胎中脑或纹状体细胞混合培养时，一部分骨髓基质细胞分化为神经元和神经胶质，分别表达NeuN、GFAP。Woodbury等［7］将β-巯基乙醇（BME）和二甲基亚枫(DMSO)加入骨髓间充质干细胞中，80%的细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝-M（neurofilament-M，NFM）、NeuN,出现神经细胞表型，诱导分化5h后细胞即出现巢蛋白，6天后消失；神经生长因子（NGF）受体trkA(一种生长因子受体)的表达，提示MSCs诱导后逐渐向成熟的神经细胞转化。以上结果表明，MSCs在体内外均有自我分化﹑扩增功能，在特定条件下向多种组织细胞分化。其自身MSCs避免了伦理﹑免疫排斥等问题，为神经干细胞应用提供了无限制的来源。
1.2.2 骨髓间充质干细胞鉴定 MSCs形态呈纤维样，可形成均匀的集落。分析表明，分离的细胞群体表型单一，细胞表面蛋白如CD29、CD44、CD17、CD106、CD120A、SH2、SH3等呈阳性。而CD14、CD34和CD45造血谱系标记则呈阴性。用于鉴定神经干细胞特异性分子标志物有：nestin、vimentin、musashil蛋白；用于鉴定神经元的标志物有：特异性烯醇化酶（NSE）、中间神经丝（NF-m）、tau-蛋白等；鉴定神经胶质细胞标志物是：胶质纤维酸性蛋白（GFAP）；鉴定少突胶质细胞标志物有：半乳糖苷酶（GalC）和碳酸苷酶（CAII）。
2 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑血管病机制
2.1 治疗的理论基础 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑血管病基于以下方面：（1）取材方便；（2）自我增殖能力、扩增迅速并有多潜能分化；（3）迁移和长期存活能力；（4）低免疫源性及良好的组织融合性；（5）移植方法简便，可直接注入侧脑室或腰穿椎管内植入，也可静脉输入，均可通过血脑屏障，向脑缺血部位迁移、分化为神经元及胶质细胞，以修复缺损的神经组织；（6）在脑的微环境中存在一些因素如神经生长因子（NGF）等有保护MSCs在脑中不被破坏，促进其增殖分化的作用。
2.2 治疗的作用机制 MSCs移植治疗缺血性损伤的作用机制是多方面的：（1）结构上的修复和环境的重建；（2）MSCs同定居部位神经组织间的相互作用，导致一些细胞因子的产生，如神经营养因子（NT）、白细胞介素类、干细胞因子等［8，9］。这些细胞因子对神经功能的恢复具有促进作用，而脑缺血后各种神经因子如脑源性神经生长因子（BDNF）、bFGF、GDNF（胶质细胞系来源的神经营养因子）、NGF、TGF-B1等在脑细胞中由于缺血被诱导产生，有助于移植的MSCs的存活、增殖和向病损部位迁移［10］。MSCs还可产生对谱系发展十分重要的自分泌和旁分泌因子［11］。Fleischman等［12］报道MSCs可以向血管内皮祖细胞分化。Takahashi等［13］认为还可向神经细胞方向的分化，有利于损伤神经、血管组织的修复，而损伤区血脑屏障的开放［10］及MSCs具有向病变组织定向迁移和发生位点特异性分化能力［14］，为MSCs静脉输入治疗脑缺血提供了更方便、简洁的办法。
2.3 MSCs移植的研究进展 MSCs目前可成功分离并可诱导分化为神经元细胞。Kopen等［15］首次报道将MSCs注入新生鼠侧脑室后可分化为神经元和神经胶质细胞，并具有一定的迁移能力。Chen等［16］将3×106个用Brdu标记的MSCs植入大脑中动脉闭塞（MCAO）的雄性小鼠体内，14天后神经损伤评分明显下降，转杆试验及粘片实验均有明显改善，在其组织学切片中，Brdu阳性细胞可在损伤脑半球的多个部位出现，如皮质、纹状体等。Fukunaga等［17］用原发性高血压大鼠MCAO，3周后将从E10.5即刻分离的带间充质的中脑神经盘立即植入缺血海马，1个月后，水迷宫试验证实移植间充质干细胞大鼠认识能力明显提高，苏木精和伊红（HE）染色发现，在移植区内有复杂的血管形成，检查出神经微丝200阳性细胞，酪氨酸羟化酶（TH）染色发现带有长树突的神经元样细胞。提示带MSCs能在成年脑中成活，分化为成熟的中枢神经系统组织细胞，并在移植区内及其周围构成血管。张化彪等［18］用免疫追踪技术发现，MSCs的迁移主要集中在患侧病灶周围如海马区、胼胝体以及大脑皮质的其他部位，同时在健侧也有少量的分布。荧光双标发现，MSCs在脑出血大鼠脑内分化为NeuN和GFAP阳性的神经元和星形胶质细胞，其中在海马处的MSCs大部分分化为神经元，在病灶周围大部分分化为星形胶质细胞。
3 MSCs移植在缺血的脑血管病的治疗进展
3.1 神经干细胞的自身激活 在成年哺乳动物体内如脑室下区（SVZ），尤其邻近侧脑室最前部分、海马齿状回的颗粒下区（SGZ）等存在极少量的具有神经再生分化能力的神经干细胞。正常情况下这些细胞处于休眠状态，在出现某些病理变化时这些神经干细胞可被激活，发生迁徙、增殖并分化。Liu等［19］对沙鼠实施10min全脑缺血，1~2周后发现，其海马颗粒层下区的神经干细胞数较正常沙鼠增长了12倍，同时这些增殖的细胞向颗粒层及齿状回迁移。1个月后，这些细胞表达NeuN和MAP2。Arridssone等［20］发现局灶性脑缺血能激发SGZ的神经再生，并发现增殖的细胞能向损伤的纹状体迁移且表达发育中和成熟的纹状体神经元的标记。Graig等［21］向小鼠脑室注射EGF后发现室管膜下区细胞逐渐向临近脑实质迁徙，其他一些因子如bFGF、BDNF、NGF也能刺激损伤后神经再生。
3.2 外源性MSCs脑内移植 由于内源性成体干细胞再生非常有限，对于大面积缺血很难修复。利用干细胞能够增殖和分化的特性，外源性MSCs的移植来实现缺血坏死区神经的修复、替代成为一个有效的策略。Li等［22］首先建立大鼠MCAO模型，4天后在麻醉状态下纹状体内注射MSCs,28天后处死，发现体内的MSCs在脑内存活，并迁移到距注射部位2.2mm处。其中有1％的细胞表达NeuN，8％细胞表达GFAP,表明MSCs在体内分化为神经元和神经胶质细胞，实验组神经功能恢复情况明显好于对照组。Toda等［23］将神经干细胞移植入缺血小鼠海马LA1区发现1%~3%移植细胞长期存活，其中的3％~9%细胞分化为神经元。这些存活的细胞改善了缺血小鼠的空间认识功能。Park［24］研究发现，小鼠出生后（Po）脑室注射外源性神经干细胞，7天后（P7）的缺氧、缺血损伤可诱导外源NSCs一过性增殖，2~5周后可见NSCs集中分布在梗死腔周围，并在半暗区发现外源性NSCs分化的神经元和少突胶质细胞增多。Kondziolka等［25］应用人类胚胎癌来源的神经细胞移植到脑卒中患者的缺血区，患者的运动症状有一定程度的提高。这是人类第一次的临床应用。
3.2.1 移植部位 多选择梗死灶周边、纹状体、海马和嗅球等部位。而梗死灶中心不利于细胞成活。Veizovic等［26］在大鼠缺血性损伤2~3周后将神经干细胞系MHP36移植入损伤对侧脑组织，MHP36移植鼠功能无显著缺陷，且缺血性脑损伤的体积较空白对照组明显缩小，空白模型动物与假手术动物相比，8周以上还表现平衡、感觉、运动缺陷，相对运动而言，3组纹状体学习与记忆功能无差异，形态学上MHP36主要见于未损伤移植半脑，在损伤半球的皮质也可见。提示MHP36通过帮助损伤与未损伤半球的组织自发重建来提高其功能。认为在损伤对侧区域移植神经干细胞可避免患侧炎性环境及较差的灌注，影响移植细胞的存活。
3.2.2 移植的时间 Mampalam等［27］报道，自大鼠MACO后2~15天进行移植。而Fukunaga等［17］认为，MCAO后3周时脑组织环境可能较为适合移植物生长。但Mattsson等［28］则认为MCAO引起的继发性丘脑萎缩于损伤3周时已形成，此时行神经干细胞移植已不能逆转脑组织萎缩。而在MCAO早期，如1周时移植对治疗继发性丘脑萎缩更加有益。移植的神经干细胞在各个阶段的脑梗死灶内均能成活，但急性期成活率低于亚急性期或晚期。可能的原因：（1）缺血急性期血供未建立，造成血供困难，营养减少；（2）缺血区的急性渗出、水肿、变性、坏死等组织释放某些神经毒性物质如自由基等；（3）急性期诱导产生的神经营养因子浓度较低，也是不易移植成功的因素。
3.2.3 移植存在的问题 目前尚无患者自体MSCs治疗脑缺血、脑出血的报道。且移植后尚有许多问题有待进一步研究：（1）MSCs移植后分化、迁移与周围组织融合及干细胞终止的调节机制尚不清楚，但迄今未见神经干细胞移植引起肿瘤形成的报道；（2）无确切证据表明，移植神经干细胞或其子代细胞与宿主神经元是否建立了真正的突触联系，从而参与宿主神经网络的形成；（3）移植干细胞的功能还有待进一步研究；（4）移植的安全性；（5）神经干细胞移植后解剖学与功能的关系仍需进一步探讨。
4 发展与展望
MSCs移植的研究为缺血性脑血管病的治疗开辟了一条新的技术平台。且MSCs能在体内外分化为神经细胞，易获得、增殖快，能够进行自体移植，克服了种族和免疫障碍，MSCs可作为一种潜在自体神经移植的一种细胞来源。
未来干细胞的研究将集中在：（1）胚胎干细胞和MSCs在对神经系统、内分泌系统等顽固性疾病临床治疗的探索；（2）药物对细胞的药理和毒副作用的筛选和评定；（3）定向制造组织、器官以用于移植、修复或治疗。（4）对人胚发育机制的研究。随着对NSCs的深入研究，MSCs的应用前景更加广阔。
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(编辑：夏 琳)
*基金项目：云南省自然基金重点项目资助（编号：2003M012Z）
作者单位： 650032 云南昆明，成都军区昆明总医院
650031 云南昆明，昆明医学院神经解剖教研室