激素相关性股骨头坏死股骨头内VEGF和BMP2的表达

　　摘  要：［目的］研究兔激素相关性股骨头坏死股骨头内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)基因表达的动态变化特点。［方法］用LPS（10 μg/kg体重）间隔24 h两次静注加MPS 3次肌注的方法制作的兔股骨头坏死模型，设计兔相关的探针和引物，通过免疫组化、原位杂交并直接提出股骨头内总RNA进行实时荧光定量PCR，研究不同时相点兔坏死股骨头内VEGF和BMP2基因表达的动态变化特点。［结果］在造模至第4、8、12、16周时，股骨头内VEGF和BMP2基因的表达免疫组化、原位杂交结果均为阴性；实时荧光定量PCR结果发现表达量均远低于空白对照组。［结论］在LPS加MPS制作的兔股骨头坏死模型中，股骨头内的VEGF和BMP2基因表达均受抑制。

    关键词：股骨头坏死；  兔模型；  血管内皮生长因子；  骨形态发生蛋白；  免疫组化；  原位杂交；  实时荧光定量PCR

      Study of VEGF and BMP2 genes expressions inside the necrotic rabbit femoral head∥ZHAO Hongbin,LI Linzhi,LI Shihe,et alOrthopedic Department of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650032

    Abstract：［Objective］To study the dynamic changes of the VEGF and BMP2 genes expressions inside the necrotic femoral head of rabbits［Method］Made rabbit model of femoral head necrosis(FHN) with the method of twice intravenous injection with low dosage lipo polysaccharide(LPS)（10 μg/kg body weight,at a time interval of 24 hours）and 3 times intramuscular injection with methylprednisolone(MPS)（20mg/kg body weight,at a time interval of 24 hours）Immunohistochemistry,in situ hybridization and extract total RNA for realtime quantitative PCR were performed and successfully designed the suitable probes and primerswas used to detect the dynamic changes of the VEGF and BMP2 genes expressions inside the femoral head of rabbits［Result］The expressions of the VEGF and BMP2 genes in group B（model group）at the 4,8，12 th and 16 th week were negative and realtime quantitative PCR showed that the level of the VEGF and BMP2 mRNA genes expressions were obviously lower than that of control group［Conclusion］The VEGF and BMP2 genes expressions are inhibited in FNH model induced by LPS and MPS

    Key words：Femoral head necrosis;  Rabbit model;  VEGF;  BMP2;  Immunohistochemistry;  In situ hybridization;  Realtime quantitative PCR

    兔是股骨头坏死（femoral head necrosis，FHN）研究中最常使用的动物。内毒素（lipo polysaccharide，LPS）加激素（methylprednisolone，MPS）制作的FHN模型，是目前报告的兔FHN发生率较高者，该模型更近似于人FHN〔1〕。由于动物种属特异性和骨结构的特殊性，对兔坏死股骨头内基因表达的研究难度较大，更少见基因表达的定量研究报告。作者用LPS（10 μg／kg体重）加MPS制作的兔股骨头坏死模型，成功设计了兔相关的探针和引物，通过免疫组化，原位杂交并直接提出股骨头内总RNA进行实时荧光定量PCR，研究了不同时相点兔坏死股骨头内VEGF和BMP2基因表达的动态变化特点，报道如下。

    1  材料和方法

    11  材  料

    111  动  物

    健康成年新西兰大白兔，体重25～35 kg，雌雄不拘，由昆明医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（滇）20050008，实验动物使用许可证号：SYXK（滇）20050004。实验兔均在昆明医学院实验动物中心实验观察室饲养用药，饲养期间给兔颗粒饲料（由昆明医学院实验动物中心提供），自由饮水，单笼饲养。

    112  仪  器

    1121  免疫组化仪器

    CM2000C型北航医学病理图像分析仪，压力锅，微波炉，PHS10A数字酸度计。

    1122  原位杂交仪器

    原位杂交加热器、微波炉、37℃恒温培养箱、50％甲酰胺湿盒及水湿盒。

    1123  实时荧光定量PCR仪器

    高速离心机（Eppendolf Centrifuge5804R，德国），紫外分光光度计（Eppendolf Biophotometer,德国），电泳槽（DYYⅢ型，北京市六一仪器厂），Opticon荧光定量PCR仪（美国MJ Research公司）。

    113  试  剂

    1131  免疫组化

    VEGF（MAB243）SP免疫组织化学试剂盒（鼠抗人，购自福州迈新公司）、羊多克隆BMP2抗体（购自福州迈新公司）、SP免疫组织化学试剂盒（羊抗鼠、兔，购自福州迈新公司）、二甲苯、梯度酒精、PBS（迈新编号：PBS0060）、苏木精。

    1132  原位杂交

    二甲苯、梯度酒精、购自武汉博士德公司的VEGF mRNA寡核苷酸探针杂交试剂盒。试剂盒适用种属：人、大鼠、兔、小鼠组织。自行合成的地高辛标记BMP2寡核苷酸探针、杂交液、生物原位杂交试剂盒（购自福建泰普生物科学有限公司，适用种属：人、大鼠、兔、小鼠组织）。

    1133  实时荧光定量PCR

    Trizol（Invitrogen，美国，批号：15596018），DNaseI（RNase Free，5 u/ml，大连宝生生物工程有限公司），RNase lnhibitor（40 u/ml，美国Promega公司）。10×Buffer RT（；德国Qiagen公司），dNTP（5mM，德国Qiagen公司），Omni script RT（40 u/ml，德国Qiagen公司），RNaseFree water（德国Qiagen公司）。SYBR Green Supermix荧光定量染料（加拿大BioRad Laboratories）。

    12  方  法

    121  分组和造模

    适应性喂养2周后，精确称重，以查随机数字表法随机分成2组，分别为空白对照组（A组）32只，模型组（B组）70只。两组兔体重和雌雄数经t检验差别无统计学意义（P＞005）。参照Yamamoto等〔1〕的方法和作者预实验的结果，B组给兔按10 μg／kg体重静脉注射LPS两次，2次注射间隔24 h，于第2次注射LPS后开始，连续3 d按20 mg／kg体重间隔24 h肌肉注射MPS。B组存活兔再以查随机数字表法随机选出32只。

    122  取  材

    于造模第4、8、12、16周末，各组各取8只兔，用大量空气栓塞法处死后，立即取出双侧股骨头，一侧迅速置于液氮罐中保存作PCR检测用。另一侧沿冠状面剖开，用20倍4％多聚甲醛液固定24 h后脱钙，常规脱水包埋切片，分别进行免疫组化和原位杂交检测。

    123  免疫组化检测

    用石蜡切片免疫组织化学SP法，按其规程操作。以棕褐色反应产物代表抗原的定位。以A组片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。综合阳性着色深浅和阳性细胞数判定表达强度。

    124  原位杂交检测

    按试剂盒说明书的规程操作。以细胞棕褐色着色为阳性，以A组片作阳性对照，综合阳性着色深浅和阳性细胞数判定表达强度。

    125  实时荧光定量PCR检测

    1251  从液氮中取股骨头，置于无菌的研钵研成粉末状后，转入离心管，以Trizol试剂加入该管后，按Trizol法的操作规程提取兔股骨头总RNA后纯化、反转录。

    1252  引物设计及合成

    兔VEGF上游引物：5′GTGGACATCTTCCAGGAGTACC3′，

    下游引物：5′GATCCGCATGATCTGCATGGTG3′。

    兔BMP2上游引物：5′CGTGAGGATTAGCAGGTCTTT3′。

    下游引物：5′GGCGTTTCCGCTGTTTG3′。

    pactin上游引物：5′CGCTGGACTTCGAGCAGGAG3′，

    下游引物：5′CAGGAAGGAGGGCTGGAACA3′。

    以上引物均由上海生工生物工程公司合成、纯化。

    1253  实时荧光定量PCR

    加入250 ng／μl的cDNA模板2 μl，10 μl SYBR Green Ⅰ荧光染料，上下游引物各05 μl，双蒸水7 μl，每个反应体系20 μl，加入定量PCR仪专用毛细管内，放入MJResearch Opticon荧光定量PCR反应仪，按如下条件进行PCR反应：95 ℃变性4 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，76 ℃ 2 s检测荧光，共40个循环。同时，做53 ℃～95 ℃范围内的溶解曲线。

    1254  数据的收集及统计学处理

    数据的收集主要由Opticon自带软件完成。通过软件可以计算出所有标准品和样品的起始循环数（CT），并且根据标准品CT值绘制出标准曲线，再根据2sac（t）法，由标准曲线计算出样本的初始拷贝数。使用SPSS 100版统计软件，采用单因素方差分析进行组间数据的比较。

    2  结  果

    21  免疫组化结果

    VEGF棕褐色反应产物为阳性定位在血管内皮细胞。BMP2阳性定位在成骨细胞。B组股骨头内VEGF和BMP2的表达在造模后第4、8、12、16周时均为阴性。

    22  原位杂交结果

    与免疫组化结果相同。

    23  实时荧光定量PCR结果

    B组在造模后第4、8、12、16周时，股骨头内VEGF mRNA和BMP2 mRNA的表达量均大大低于A组，差别均有非常显著的统计学意义（P＜001）。具体为：在造模后第4、8、12、16周时，股骨头内VEGF mRNA的表达量分别为A组的01 214、01 360、02 789、01 293倍；BMP2mRNA的表达量分别为A组的01 272、01 318、01 452、01 433倍。

    3  讨  论

    FHN一般自死骨边缘和周围活组织结合部开始修复，表现为血管再生，新骨形成和死骨吸收〔2〕。但随着修复向死骨中央推进，死骨吸收增强，而血管再生和新骨形成明显减弱。VEGF可随着死骨修复在股骨头内表达。VEGF的表达受一系列激素、生长因子和细胞因子的调节，其中缺氧是最主要的调节因素之一〔3〕。FHN病因存在的多种学说的共同点是股骨头血液供应的减少，使股骨头缺血缺氧而发生坏死，由此，VEGF在受损的坏死股骨头内似应受缺氧及压力增加等诱导而表达水平较高。Vadasz等〔4〕采用切断鼠股骨颈骨膜和圆韧带的FHN模型中发现股骨头内VEGF早期为高表达。而因激素相关性FHN中血管内皮细胞的功能受到了破坏，激素的直接毒性作用〔5〕反而使VEGF的表达降低，组织修复能力下降。Li等〔6〕用骨髓间充质细胞进行的体外研究发现，糖皮质激素（地塞米松，DEX）可使VEGF蛋白降低55％。樊粤光等〔7〕用LPS（50 μg／kg体重）加MPS的兔FHN动物模型进行原位杂交研究，发现6周时VEGF mRNA在血管壁周围的表达较强，但是随着时间的推移，表达逐渐减弱，在10周时表达较低，14周时又可见稍有增加，但仍然较正常组低。而作者用低剂量LPS（10 μg／kg体重）加MPS制作的兔FHN动物模型进行的研究，通过应用免疫组化、原位杂交等技术检测，结果均显示，模型组股骨头内VEGF的表达在造模后第4、8、12、16周时均为阴性。用实时荧光定量PCR技术检测股骨头内VEGF mRNA的表达也较正常组大大降低，仅在第12周时可见表达量有增加，达第4、8、16周时的2倍余，但仍然较正常组显著降低，说明FHN中VEGF mRNA的表达受到显著抑制，血管再生极慢使骨修复能力明显下降，新骨形成也明显减慢减弱。

    目前有关BMP2与FHN关系的研究报告较少。薛元锁等观察了正常兔股骨头内骨形态发生蛋白2的分布规律，发现成骨细胞在向成熟骨细胞分化的过程中，其合成BMP2的能力逐渐降低，最后消失。他们在醋酸氢化泼尼松诱发早期股骨头坏死动物模型内发现，糖皮质激素使BMP2表达受抑制，抑制程度与用药时间和用药剂量正相关〔8〕。作者用低剂量LPS加MPS的FHN模型，通过免疫组化、原位杂交和实时荧光定量PCR等技术检测坏死股骨头，均发现该模型内BMP2基因的表达量远较正常组低，即使到造模16周，其表达量也远低于正常组，表明BMP2的表达不仅受到了抑制，而且受抑制的持续时间较长。

    VEGF和BMP2可相互影响而促进骨修复。Yeh等〔9〕发现VEGF通过促进局部血管增生和成骨细胞分化而参与了成骨活动，而其它骨生长因子，如TGF13，BMP等则通过提高成骨细胞VEGF的表达而在骨的形成和修复中发挥作用，这些骨生长因子可刺激VEGF在体内表达，VEGF不足可导致血管腔闭合，血管退化。而BMP2在兔角膜中不能诱导血管生成，但它能通过刺激VEGF来诱导血管形成〔10〕。在我们用低剂量LPS（10 μg／kg体重）加MPS制作的兔FHN模型中股骨头内VEGF和BMP2表达较长时间的显著减少，使该模型具有与人相似的激素相关性FHN修复较慢的表现，由此也为用该模型进行相关的研究建立了有利的平台。

    参考文献：

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    〔6〕  Li X,Jin L,Cui Q,et al.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expres sion［J］.Osteoporos Int,2005,16（1）:101108.

    〔7〕  樊粤光，徐传毅，何伟，等.激素性股骨头坏死病程中股骨头局部VEGF mRNA表达的变化及意义［J］.中国矫形外科杂志，2002，10（8）：784786.

    〔8〕  薛元锁，时述山，李亚非，等.激素性股骨头坏死病程中骨形态发生蛋白2的改变及其意义［J］.中华实验外科杂志，2000，17（5）：455457.

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    （昆明医学院第一附属医院骨科，云南省昆明市西昌路295号  650032）