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摘 要：［目的］建立颈椎后路手术动物模型，增加后纵韧带的张力，检测后纵韧带中BMP2及BMP7的表达及水平，探讨机械应力刺激对后纵韧带骨化的作用机理。［方法］SD大鼠100只，分为5组，每组20只，手术方式：（1）颈椎后路全椎板切除组；（2）颈椎后路全椎板切除+肌肉切断组；（3）单纯椎旁肌止点切断组；（4）假手术组，仅作切口，剥离椎旁肌暴露；（5）对照组，不作任何处理。分别于术后1、2、4、8周，取实验动物手术节段后纵韧带标本，PCR方法检测BMP2及BMP7的表达水平。［结果］（1）颈椎手术后，全椎板切除+肌肉切断组BMP2，BMP7水平上升最明显，与对照组比较有统计学差异；（2）颈椎后路全椎板切除组BMP2，BMP7水平水平上升，与对照组比较有统计学差异；（3）单纯椎旁肌止点切断组BMP2，BMP7水平上升，与对照组比较有统计学差异；（4）假手术组BMP2，BMP7水平与对照组比较无明显变化。［结论］手术导致的机械刺激提高BMP2，BMP7在大鼠后纵韧带内的表达水平；认为虽然动物模型不能完全模拟人体情况，但是BMP2，BMP7在OPLL的早期可能具有始动作用，而BMP7在后续的骨化过程中可能继续发挥作用。建议临床手术时应尽量采取微创，减少术后不稳增加后纵韧带的应力。
关键词：后纵韧带骨化； 骨形态发生蛋白； 聚合酶链反应
Influence of different operations on BMP2,BMP7 in rat posterior longitudinal ligament∥TAN Bingyi,JIA Lianshun,WANG Haiyan,et alDepartment of Orthopaedics Surgery,Changzhen Hospital,Shanghai 200003，China
Abstract：［Objective］To discuss the initiating and developing mechanism of OPLL,and the influence of different operations on happening and developing of OPLL［Method］We subgroup healthy adult SD rats into groups,did operation on C3~6 levelThe first group:laminectomy;the second group:laminectomy and muscle cutting;the third group:muscle cutting only;the fourth group:exposure only;contrasting group:no treatmentWe got the tissue of posterior longitudinal，ligament at 1，2，4，and 8 weeks postoperation and quantify BMP2 and BMP7 by PCR method［Result］BMP2，BMP7 increased significantly in the 1st，2nd and 3rd group compared with the contrastinggroup；BMP2，BMP7 of only exposure group had no significant difference compared with the contrasting group［Conclusion］BMP2 and BMP7 play important roles in the early stage of OPLL，they could be the onsetting factors of OPLLBMP7 may play an important roles in the later ossification period
Key words：Ossification of the posterior longitudinal ligament（OPLL）； Bone morphogenetic protein（BMP）； Polymerase chain reaction（PCR）
后纵韧带骨化（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）病因不清，研究认为后纵韧带骨化可能与基因、多种激素水平及某些矿物质代谢有关。要明确后纵韧带骨化的真正机理，还需要深入研究。
近来文献报道颈椎后路术后OPLL有明显发展的迹象，考虑与手术导致后结构破坏，后纵韧带承受机械应力增加有关系。但目前尚无模拟手术增加后纵韧带机械应力的动物模型及其相关研究。作者设想在大鼠颈椎进行后路手术，造成后纵韧带的应力上升，检测相关的BMP2，BMP7的表达及含量，探讨机械应力刺激对后纵韧带骨化的作用机理，为临床手术提供理论依据及参考。
1 材料与方法
成年健康SD大鼠100只，体重300~350 g，随机分为5组。3%戊巴比妥钠30 mg／kg静脉注射麻醉。在C3~6椎体节段行手术：（1）颈椎后路全椎板切除组；（2）颈椎后路全椎板切除+肌肉切断组；（3）单纯椎旁肌止点切断组；（4）假手术组，剥离椎旁肌暴露椎板；（5）对照组，不作任何处理。
分别于术后1、2、4、8周，取实验动物手术节段后纵韧带标本，PCR方法检测BMP2及BMP7mRNA的表达水平。测序分析证实电泳结果为目的片断。应用两组间均数t检验进行统计分析。
2 结 果
各组BMP2及BMP7的测定结果如下：未作手术组及单纯暴露组BMP2及BMP7的PCR电泳结果为阴性，没有条带显示（图1~2）。 图1BMP2 1、2、4、8周的电泳照片图2BMP7 1、2、4、8周的电泳照片21 BMP2表达（1）术后4周之内，BMP2的水平呈现上升趋势，术后8周BMP2的水平下降。（2）组间比较：肌肉组、全椎板组、全椎板+肌肉组在术后1、2、4及8周时的后纵韧带内BMP2的表达比较P值均小于001，各组间具有极显著性的差异；单纯手术暴露组、对照组PCR结果为阴性，未见BMP2的表达，各手术组与单纯手术暴露组及对照组BMP2的表达水平存在显著差异。（3）各组术后1周与2周BMP2的表达P值均小于001，存在显著性差异；肌肉组、全椎板组、全椎板+肌肉切断组术后2周与4周BMP2的水平无显著性差异；各组术后8周较4周BMP2的水平均明显下降，P值均小于001（表1）。 表1 BMP2的测定结果表2 BMP7的测定结果
3 讨 论
后纵韧带骨化病因不清，认为后纵韧带骨化可能与基因、多种激素水平及某些矿物质代谢有关〔1〕。
骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）属于转化生长因子β（transforming growth factor β,TGFβ）超家族的成员，具有多种生物学功能。
已有实验证明，间充质细胞在分化过程中如果不受BMPs等因子的作用，它在生命中都不会分化形成软骨和骨〔2〕。
BMP2正常情况下由幼年成骨细胞分泌，不仅可刺激骨组织来源的细胞株向成骨细胞系方向分化，还可以改变非骨组织来源的细胞株的分化方向，使其向成骨细胞系方向分化。此外，BMP2在骨细胞分化过程中，具有调节其它BMPs基因的表达作用〔3〕。
BMP2 mRNA的表达水平与韧带组织中成纤维细胞软骨化生的活跃程度呈正相关，BMP2存在于骨化区域及其邻近纤维软骨化区域的间质及成纤维样细胞中，分析BMP2在脊柱韧带骨化过程中起重要作用〔4〕。
韧带骨化过程中内源性BMP2随着骨化的渐趋成熟，其表达量逐渐减少。BMP2在骨生长和愈合中所起的作用主要是使具有生骨潜能的间充质细胞向骨及软骨细胞分化，而对于已成熟的骨和软骨细胞基本无促增殖作用〔5〕。
BMP在牵引成骨及骨折愈合新骨生成过程中，在将机械张力转变为生物效应的信号通路中起重要的调节作用。体外后纵韧带的细胞培养实验证明，拉力状态之下，细胞合成分泌BMP2、BMP4及ALP的水平明显上升〔6〕。
作者的研究结果提示，正常后纵韧带内BMP2 mRNA没有表达，手术组在6周时间之内，BMP2 mRNA的表达呈现上升。至8周时，BMP2 mRNA呈现下降趋势，提示BMP2可能主要由韧带内的成纤维细胞合成分泌。BMP2在OPLL的早期阶段可能发挥主要作用，使具有生骨潜能的成纤维细胞向软骨细胞分化，进入后期，成纤维细胞发生分化成熟，BMP2的合成水平降低，BMP2 mRNA维持在较低的水平，其后期作用尚待研究。
BMP7具有较强的诱导成骨作用〔7、8〕。BMP7在后纵韧带骨化组织邻近钙化区的软骨细胞内有表达，正常人无BMP7的表达。BMP7可能在软骨化骨过程的软骨钙化过程及骨化前血管长入过程中发挥作用〔9〕。
BMP7在骨骼发育的不同阶段均具有调节作用，表现为促进碱性磷酸酶和软骨细胞蛋白多糖的表达，并调节BMP家族其他成员的mRNA的表达，在成骨细胞系的生长分化过程中发挥作用〔10〕。BMP7通过作用于软骨内骨化的两个阶段从而影响软骨细胞及成骨细胞表型的分化。在OPLL病人的后纵韧带检测中，BMP7存在于骨化区域的软骨细胞中〔11〕。
作者的实验结果表明在前8周，BMP7的水平呈现持续上升的现象。作者认为BMP7在OPLL早期参与成纤维细胞的分化，后续时期对软骨细胞及骨细胞发挥作用，调节其他细胞因子的水平，参与韧带骨化的全过程。
通过研究作者认为：手术导致的应力刺激可以使后纵韧带骨化的始动因子水平上升。所以对于颈椎后路的手术方式提出忠告，应多采取微创方法，尽量减少对有效结构的破坏，减少术后颈椎不稳定的倾向，减少颈椎后纵韧带的应力刺激，防止术后后纵韧带骨化的进一步发展。
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（1上海长征医院骨科，上海市凤阳路415号 200003；2泰山医学院，山东泰安 271000）