冲击波干预成人骨髓间充质干细胞后IGFⅠ和TGFβ1的表达及意义

　　摘  要：［目的］在体外成功分离培养骨髓间充质干细胞（hMSCs）和测得理想冲击波（ESW）干预能量的基础上，观察体外冲击波干预后成骨活性因子IGFⅠ和TGFβ1表达，探讨其促进成骨作用。［方法］将5kV、100频次的体外冲击波作用于第1代骨髓间充质干细胞，采用免疫细胞化学法隔代观察（P1P11）胰岛素样生长因子Ⅰ（IGFⅠ）和转化生长因子β1（TGFβ1）的表达，计数阳性率；并进行统计学分析，设定P＜005为有统计学差异。［结果］ESW干预后的第3代细胞IGFⅠ染色，胞浆及胞核中出现大量黄色棕黄色颗粒，对照组无明显着色；第7代干预组IGFⅠ呈强阳性（879%）；TGFβ1出现较晚，第9代细胞TGFβ1阳性率为722%，随后开始下降；与对照组差异显著（P＜001）。［结论］ESW干预能够提高hMSCs增殖活性，IGFⅠ和TGFβ1等的不同时期和不同程度表达是体外冲击波促进hMSCs成骨活动的适时信号和有力证据。

    关键词：体外冲击波；骨髓间充质干细胞；胰岛素样生长因子Ⅰ；转化生长因子β1

    Expression and signififcance of IGFⅠ TGFβ1 in human mesenchymal stem cells after exposured to extracoporeal shock wave∥WANG Wuzhou,XING Gengyan,YE Qibin,et alDepartment of Orthopedics,General Hospital of the Chinese Peoples Armed Police Forces,Beijing 100039，China

    Abstract：［Objective］To demonstrate mechanism of ESW in curing osteogetic disorders,we studied expression of some osteogenetic factors in human mesenchymal stem cells（hMSCs）when exposed to ESW［Method］After success in marrow aspiration,isolation and obtainment optimal experimental energy,a dose of 5kV and 100 times of ESW was applied to hMSCs of passage 1The expression of IGFⅠ and TGFβ1 were examined by immunocytochemical staining［Result］The cytochemical staining results showed that expression of IGFⅠ and TGFβ1 appeared at different passage of hMSCs after ESW interventionAppearance of IGFⅠ was earlier than TGFβ1 which didnt express until passage 7At the same interval,the expression of IGFⅠ and TGFβ1 in control group difference is lower than ESW group,respectively（P＜001）［Conclusion］ESW of 5kV and 100 times can improve hMSCs proliferation,which is associated with the appearance of osteogenetic factors,such as IGFⅠ and TGFβ1

    Key words：Extracorporeal Shock Wave（ESW）;  Human mesencbymal stem cells（hMSCs）,  Insulinlike growth FactorⅠ（IGFⅠ）;  Transforming Growth Factorβ1（TGFβ1）

    根据体外冲击波（ESW）物理特性开展的体外冲击波疗法（ESWT）已被广泛的用于骨科慢性软组织损伤的非手术治疗；近些年，国内外又有学者将ESWT用于成人早期股骨头缺血性坏死的保守治疗〔1、2〕；然而，体外冲击波疗法治疗骨肌系统疾病的机理仍不清楚，目前有关冲击波干预体外培养的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的文献报道甚少。本研究在体外成功分离培养骨髓间充质干细胞（hMSCs）和测知理想冲击波干预能量的基础上，观察体外冲击波干预后成骨活性因子IGFⅠ和TGFβ1表达，探讨ESW的促进成骨作用，为进一步扩展体外冲击波疗法治疗成骨障碍性疾病提供理论依据。

    1  材料与方法

    11  主要试剂与仪器

    主要仪器：ESW冲击波发生器（ESWOAJ型）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympus，日本）；台式高速离心机（DAMON/IEC，美国）；细胞培养箱（HERACell150型，德国）；生物安全柜（HealForce，德国）；培养瓶、皿（Corning，美国）；多孔培养板（Costar，美国）；电热恒温振荡器（THZC型）：WD 9001微波炉（格兰仕，广州）。主要试剂：Percoll原液（1024 g／m，Phamasia，美国）；DMEMLG培养基（Gibco，美国）；优质胎牛血清（江苏四季青）；胰蛋白酶（Amresco，美国）；亲和纯化兔抗人IGFⅠ和TGFβ1抗体（武汉博士德生物公司）；生物素化羊抗兔IgG（武汉博士德生物公司：多聚甲醛和DAB显色试剂盒（北京鼎国生物）：青链霉素双抗（吉诺生物医药公司）。

    12  骨髓标本的获取

    取自年龄18~45岁的早期成人股骨头缺血性坏死患者，经辅助检查排除血液及其他脏器病变，双方签署知情同意书；自髂前上棘处骨髓穿刺，用肝素化（200 U／ml）的50 ml注射器抽出骨髓20~30 ml，立即注入肝素化的灭菌标本瓶中充分混匀；于超净工作台内尽快行分离操作。

    13  骨髓间充质干细胞的分离

    根据密度梯度分离的原理和Stokes定律，骨髓中的单个核细胞将会停留在密度为1073~1077 g／ml的分层界面;实验中选用Percoll液进行骨髓间充质干细胞分离；按照Percoll梯度分离液配制公式，用10×PBS将Percoll原液稀释成60%浓度的梯度分离液，调节pH至72，并以1%的Ca2+／Mg2+液调节渗透压至295~310mOsmol／L。将抗凝的骨髓血稀释，1 000 r／min，离心Stain，去除上层脂肪滴；将余下的内容物重悬，并沿管壁缓慢加入含等量细胞分离液的离心管中，甩平头梯度离心（2 000 r／min，R=175 mm，20 min），观察分层情况，仔细吸取分层界面的云雾状悬液，PBS漂洗2次（1 500 r／min，R=80 mm，10 min），加入DMEMLG完全培养基，反复抽吸吹打制成单细胞悬液，计数培养。

    14  受试对象的分组及干预

    原代hMSCs长满至80%时，加入025%胰蛋白酶-001%EDTA消化制成细胞悬液，即P1代；调整细胞密度在1~15×105个／ml的水平，然后各取5 ml细胞悬液，等量接种于25 cm2细胞培养瓶中，分别标记为对照组（C）和干预组（E）。干预组hMSCs使用ESWOAJ治疗仪施加最佳能流密度016 mJ／mm2，即5 kV、100频次的体外冲击波干预；对照组样本不施加干预。两组受试对象均置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件的孵育箱培养。

    15  免疫细胞化学染色

    分别采用SABC免疫组织化学染色法，对干预组和对照组hMSCs隔代染色，观测细胞膜、浆或核中IGFⅠ和TGFβ1等成骨活性因子表达。使用IGFⅠ和TGFβ1单克隆抗体及相应SABC免疫组化试剂，按照免疫组化染色实验操作流程摸索适宜条件，并在同一批次用005 mol／LPBS代替一抗作为空白对照。具体步骤如下：

    细胞传代时取干预组和对照组hMSCs悬液，分别接种在预先灭菌的24孔培养板，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件的孵育箱培养72 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗5 min，共3次；03%的H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶30 min，蒸馏水洗3次；滴加5%BSA封闭液，室温20 min，甩去过多液体，不洗；干预组和对照组分别滴加兔抗人IGFⅠ、TGFβ1一抗（各5孔，并设PBS对照1孔），4 ℃过夜，PBS漂洗2 min，共3次；滴加生物化山羊抗兔二抗IgG50μl，室温孵育20 min，PBS漂洗2 min，共3次；滴加SABC 50 μl，室温孵育20 min，PBS漂洗5 min，共4次；DAB试剂盒显色9 min，显微镜下观察，适时蒸馏水冲洗。苏木精轻度复染细胞核1 min，95%和99%酒精梯度脱水各两次，每次1 min；显微镜下观察:①细胞膜、胞浆或胞核被DAB染成棕黄色或棕褐色;②细胞核比较清晰；③形状比较规则；④轮廓比较清楚，即为表达阳性，未显棕黄色者为阴性；如果细胞核阳性，则放弃苏木素复染，以免影响结果观察。再根据颜色的深浅将阳性表达分为4级：微阳性（+）、弱阳性（++）、中度阳性（+++）、强阳性（++++）。计数每组高倍镜视野下1 000个细胞中的阳性细胞数，计算该组的阳性率。

    16  数据分析

    数据处理应用SPSS115统计软件，采用行x2检验进行统计学分析，检验标准：α=005。

    2  结  果

    21  IGFⅠ的阳性表达

    在ESW干预后的不同时期，IGFⅠ的表达和定位也发生着相应变化，干预后14 d（P3代）进行细胞飞片IGFⅠ免疫组化染色，即有部分细胞浆和胞核被染成棕黄色，阳性率为423%；而对照组无明显着色，仅个别细胞浆轻度黄染，呈弱阳性（81%）；随后的染色显示IGFⅠ阳性细胞数在逐渐增加，在P7代干预组的细胞浆及细胞核中出现大量黄色、棕黄色深染的颗粒，呈强阳性，阳性率为879%：而对照组IGFⅠ的阳性表达不明显；P9代之后干预组IGFⅠ的表达持续呈强阳性，阳性率在85%~95%，而对照组始终未见高阳性率和强阳性表达（图1~2、表1）。干预组IGFⅠ阳性表达出现时间早于对照组，提前了4代，约25 d。经x2检验：ESW干预组的阳性率明显高于对照组，两组间显著差异（P＜001）。 表1  体外冲击波干预对骨髓间充质干细胞IGFⅠ表达的影响转化生长因子（TGFβ）在成骨诱导中被认为是极具潜力的因子。本实验中，骨髓间充质干细胞的TGFβ1阳性表达出现较晚；冲击波干预后的P5代出现个别细胞中TGFβ1弱阳性表达（52%），至P7代hMSCs的胞浆可见均匀、淡染的黄色颗粒，细胞核被苏木素蓝染，核仁清晰可见，P9代细胞即有明显的TGFβ1阳性表达，阳性率为722%，个别细胞的胞浆还出现了深染的棕褐色颗粒（强阳性）；随后各代细胞阳性表达开始减弱；而对照组始终没有出现明显黄染的阳性或棕染的强阳性细胞（图3~4、表2），两组间TGFβ1阳性率差异显著（P＜001），ESW干预组明显高于对照组；而且，TGFβ1阳性表达较IGFⅠ晚6代，约40 d，高峰持续时间短，仅在P9代细胞。

    图1第5代对照组细胞IGFⅠ免疫组化染色，未见明显胞浆、胞核黄染，仅个别细胞浆轻度着色（IC：10×40）  图2ESW 干预组第5代细胞IGFⅠ阳性表达明显，细胞浆呈棕黄色，部分胞核着色，核仁明显（IC：10×40）  图3对照组第9代细胞TGFβ1免疫组化染色阳性细胞较少，仅部分细胞出现均匀黄染（IC：10×40）图4ESW干预组第9代细胞TGFβ1免疫组化染色呈均匀阳性，个别细胞的胞浆还出现了深染的棕褐色颗粒（IC：10×40）表2  体外冲击波干预对骨髓间充质干细胞TGFβ1表达的影响

　　3  讨  论

    体外冲击波（ESW）因为携带有巨大能量，最初是被用于治疗泌尿系、消化系结石。上世纪90年代初人们偶然发现体外冲击波对治疗骨肌系统慢性疾病有效，随后被逐渐用于骨缺损、骨不连、骨折延迟愈合、肩关节周围炎、高尔夫球肘，网球肘、弹响髋、跳跃膝、跟痛症及跖筋膜炎等的非手术治疗。近些年国内外学者尝试将ESWT用于早期成人股骨头缺血性坏死的保守治疗，也取得了喜人的疗效〔1、2〕。骨髓间充质细胞是本世纪70年代最先被Freidenstein等人发现的一种具有多向分化潜能的干细胞，其来源充足，取材方便，扩增能力确切，在体外研究及体内骨与软组织损伤修复方面显示出良好的前景〔3〕。

    生物体内存在多种细胞生长因子。它们中的大部分能提高细胞活性，促其增殖与分化，而且各种生长因子之间可以有相互协同或抑制作用。几乎所有细胞都需要多种生长因子来维持。当去除生长因子或受体时，不可避免地会发生细胞凋亡。因而，骨细胞对ESW生物学效应的感知和应答过程中可能有IGFⅠ、TGFβ1、BMPs、CBFα1等多种生长因子的参与，并涉及多种信号转导通路〔4〕。

    胰岛素样生长因子（IGF）是因其化学结构与胰岛素原类似而命名。它是一族既有胰岛素样合成作用又有生长促进作用的多肽，包括IGFⅠ和IGFⅡ。IGFⅠ作为有丝分裂原，是细胞从G1期向S期转变所必需的因子，在骨和软骨的生长发育和重建过程中充当了极重要的角色。IGFⅠ与其相应受体结合后可以经过一系列信号转导把有丝分裂和代谢信号传递到细胞核，通过增加DNA的合成、上调细胞周期蛋白的表达，加速细胞在G0/G1期后的6h由细胞分裂的限制点（R）进入S期，从而发挥调节蛋白质的合成促进细胞增殖等相应的生物学效应〔5〕。在本研究中，在早期的骨髓间充质干细胞中IGFⅠ的表达为阴性，说明具有生理活性的IGFⅠ早期只是以一种“储存库”的形式存在，直到第7代才有明显阳性表达，说明正常骨髓间充质干细胞多处于未分化状态，分裂静止期较长；在有ESW等力学刺激下，内源性IGFⅠ的表达出现较早，干预后两周的hMSCs胞浆及胞核中即出现大量黄色、棕黄色颗粒，IGFⅠ阳性表达明显；并呈现逐步升高趋势，在干预后的第9代IGFⅠ阳性率高达882%；而对照组呈中等阳性，其出现时间较干预组晚了4代，约25d。这与Schumacher等〔6〕报道的牵张成骨过程中IGFⅠ水平相仿；其检测发现牵张早期兔骨膜中IGFⅠ增高明显，仅有少量矿化骨质形成，牵张结束后大量IGFⅠ恢复到正常水平。可见，IGFⅠ与成骨分化密切相关，早期骨髓间充质细胞无明显分化趋向，故含量较低；无论有或无外界因素干预，只要出现成骨趋向，即有IGFⅠ的表达；而且，随着矿化骨形成，其表达会减弱，即IGFⅠ仅出现在成骨的早期阶段，并可能与其它生长因子有着密切的协同或互遏关系。

    转化生长因子（TGFβ）首先从人的血小板、胎盘和牛肾脏匀浆中提纯获得。它广泛存在于人体组织细胞中，以骨组织和血小板中的含量最丰富，多由成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞等合成，其浓度远远高于其他组织。TGFβ1在其5种亚型中的比例最大、活性最强，参与机体许多生理和病理过程。TGFβ1具有广泛的生物学活性，在骨诱导过程中被认为是极具潜力的因子〔7〕。然而，针对其作用人们的看法不一：（1）TGFβ1促进细胞增殖，但不参与成骨分化；（2）TGFβ1对细胞的增殖无作用，但能刺激其分化；（3）TGFβ1抑制细胞的增殖和成骨分化。在本研究对照组正常生长的骨髓间充质干细胞增殖晚期（第9代），TGFβ1呈弱阳性表达，说明TGFβ1不是影响骨髓间充质干细胞增殖的主要因子，可能是分化活动的起始因子，但因缺乏有效的诱导因素，细胞走向衰老、凋亡，没有出现TGFβ1的强阳性表达。作者认为：TGFβ1，在正常骨髓间充质干细胞增殖过程中作用不大，但可能出现在骨发生之前的诱导成骨过程中，需要有效的刺激或与特殊蛋白质协同表达。

    已有文献报道，机械牵张等力学刺激的早期大鼠成骨细胞中出现TGFβ1基因的表达高峰，直至固定期4周后才降至正常水平〔8〕。Wang FS等报道适宜能流密度的ESW可以使骨髓基质细胞BMMSCs中AKP活性增强，TGFβ1的表达增多〔9〕。作者通过免疫细胞化学染色也观察到骨髓间充质干细胞中TGFβ1的阳性表达，但是出现较晚；在增殖旺盛的第5代干预组hMSCs中仅见个别细胞呈弱阳性，当第7代细胞表现出成骨分化趋向时，hMSCs胞浆中出现均匀、淡染黄色颗粒，到第9代TGFβ1蛋白表达最多（722%），随后阳性率开始降低。可见，在ESW干预的晚期，TGFβ1出现并参与诱导了hMSCs分化过程。但其持续时间短，仅在P9代干预组细胞。Chen YJ等〔10〕的的报道支持作者的结果。可见，具有活性的TGFβ1，是在体外冲击波干预骨髓间充质干细胞后较晚合成和分泌的，在hMSCs分化过程起开关作用，并不伴随成骨的全过程；而且，TGFβ1可能只起着趋化作用，hMSCs细胞最终是否分化成骨是由其它因素与之协同决定的。

    本试验中，TGFβ1并未与IGFⅠ同时出现，其阳性表达较IGFⅠ晚了约40 d，说明这两种成骨活性因子间无协同作用，而是各自在不同阶段发挥相应的成骨诱导作用，且有明显的时效关系。

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