韧带和肌腱修复的组织工程研究进展

　　韧带和肌腱是平行纤维带，由致密结缔组织构成，对保持关节正常运动和稳定性起重要作用。这些结构损伤可导致明显关节不稳，引起其它组织损伤及发展成退行性关节疾病。在一些病例中，如膝关节前交叉韧带损伤后不能自愈，需替代物移植治疗。修复或重建损伤韧带和肌腱可选择3种生物替代物：自体移植物、同种异体移植物，及异种移植物。自体移植物已经取得了最满意的长期效果［1］，但供体部位常出现疼痛、肌肉萎缩、肌腱炎等，是主要限制性因素［2］。冰冻异体韧带移植物常导致免疫反应，阻碍了组织重建，但存有传播疾病的风险，缺少供体及供体与受体之间的相容性是主要问题。牛移植替代物因为偶然出现反复渗出、移植失败及滑膜炎等未取得FDA认证。另外，各种合成材料已经用于韧带置换，但855种假体韧带随访15年均未取得满意结果［3］。
   
　　组织工程是一项基于发展生物结构来修复、重建或替代生物组织的技术。组织工程应包括修复细胞，结构模板，且易于营养物质和代谢物质运输，及提供分子和机械调节信号。韧带和肌腱修复的组织工程应包括：(1)自体细胞来源；(2)生化及物理因素调节BMSCs分化；(3)生物支架；(4)生物反应系统。

　　1  细胞来源
       
　　理想的情况是用自体细胞来消除异体细胞带来的问题，如免疫排斥和疾病传播。成人骨髓是骨髓基质干细胞库，骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSc)能自我更新并具备向各种间质细胞分化的能力。BMSCs具备几点特殊的性质使它成为各种组织工程的明确选择：(1)能形成纤维母细胞单个集落，可根据其黏附于固体表面的能力将其分开并可扩增得到大量细胞［4，5］；(2)BMSCs数量随着年龄增长而减少［4］，但在新生儿和年长者该细胞的增殖、分化能力无明显差异［6］；(3)可通过设定不同的培养条件诱导BMSCs向不同的间质表型分化，包括成骨的骨母细胞，成软骨的软骨细胞，储存脂肪的脂肪细胞，和成肌腱／韧带细胞［7］；(4)由BMSCs形成的组织工程韧带可作为合适的自体移植物，无需除手术部位以外的外科手术(传统自体移植时需要)，且无免疫反应的危险(异体移植时可出现)。
   
　　2  调节因子

　　2.1  生化因子
   
　　生化因子对诱导和／或支持特殊间质细胞系的表达起着重要作用。氧气可影响细胞外基质的合成率及体外组织工程组织的发育［8］。氧气是否会影响干细胞向韧带纤维母细胞分化还不清楚。Fermor等［9］研究显示高氧浓度(21％)最大程度支持前交叉韧带纤维母细胞分化，而低氧浓度(10％)增强细胞外胶原合成。维生素C磷酸酯作为长效维生素C来源，明显增强体外培养细胞活性并提高I型胶原表达水平［9～11］。生长因子如表皮生长因子(EGF)，碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)，和转化生长因子β(TGFβ)可增强细胞增殖［12～14］。另外，胰岛素、TGFβ、和IGFⅡ可促进结缔组织蛋白表达及细胞外基质产生［14～16］。TGFβ与EGF，及TGFβ与胰岛素可协同作用刺激纤维母细胞和间质细胞增殖［13，17］。Moreau等［11］利用高级DMEM(ADMEM)培养基体外培养BMSCs，无论是否添加生长因子，与DMEM培养基相比，均可明显提高BMSCsI型胶原表达水平。联合应用EGF和TGF(先后应用)可最大限度提高细胞增殖及I型胶原表达。生长因子对骨髓基质干细胞的影响存在剂量依赖性，Hankemeier等［18］研究证明低剂量bFGF(3 ng／ml)明显促进骨髓基质干细胞向纤维母细胞方向分化，并明显增加韧带和肌腱特异性细胞外基质和细胞骨架成分的表达，而高剂量bFGF(30 ng／ml)则无此作用。

　　2.2  应力刺激
   
　　影响体内韧带生长发育的机械信号对于体外组织工程韧带的培养同样起着重要作用。施加应力可至少在两方面影响组织发育：(1)加强质量传递；(2)直接刺激细胞。对培养的韧带纤维母细胞施加机械刺激可增强I型和Ⅲ型胶原、纤维结合蛋白及黏蛋白-C的表达［19,20］。在缺少特殊生长因子和调节因子作用下，对人类BMSCs施加生理性周期拉力，BMSCs即可向韧带样细胞分化［21,22］。应力通过直接影响细胞形状和原纤维间隙，或通过液体流动增强来自细胞和从细胞发出的质量传递，可改变自体和组织工程韧带的细胞外环境。
   
　　3  生物支架
   
　　支架结构的机械性质和降解率在很大程度上决定了在细胞和组织水平上的机械传递。对承受应力的组织进行组织工程修复，在新生组织具备一定的机械性能前保持支架的机械性能是对支架设计的一个很重要的要求。
   
　　生物材料支架为细胞黏附和组织发育提供了结构模板，且生物降解率要与组织形成保持平衡。研究显示支架对于促进组织有规则地修复必不可少［23］。支架结构决定营养物质、代谢物质和调节分子转入和转出细胞，而支架的机械性质决定细胞和组织水平的机械传导。理想情况下，支架应由生物降解材料制成，且其降解率与新组织形成相配，并具有良好的生物相容性。生物材料可用来输送调节分子，调节分子通常添加在培养基中［24］；也可与支架结合进行局部应用［25］。生物工程能大大受益于新一代生物诱导型生物材料支架，例如可输送多种生长因子［26］或根据机械应力释放生长因子［27］。

　　3.1  胶原支架
   
　　商用高纯度I型胶原已经用于制成凝胶和平行纤维束。胶原在静态张力下可支持韧带纤维母细胞生长。I型胶原凝胶为韧带纤维母细胞增殖提供三维环境及在机械应力下形成组织［２１］。将人类BMSCs种植于交联胶原纤维，其支持细胞黏附、扩散及细胞外基质沉积包裹纤维。培养1 d后，细胞形成局部接触，呈梭形，并沿支架纤维排列。培养3 d后，平滑单层细胞形成，细胞数随培养时间增加。但支架承受机械应力能力随培养时间而下降，结果支架纤维不能向黏附的BMSCs传递重复的应力。胶原纤维的机械性能较差不利于其体外(在生物反应器)和体内(在膝关节)的固定。

　　3.2  丝支架
   
　　丝已经在临床应用多年，并且又应用在组织工程上。经过处理的天然丝无相应生物危险性，在体内和体外都具有较低生物降解率，且其机械性质较好。与临床应用的大多数材料相比，丝是一种缓慢降解，具有较好生物相容性的生物材料。原丝经过处理去除潜在过敏原-丝胶蛋白。
   
　　当制成合适的钢缆几何结构时，丝纤蛋白的机械性质与功能与前交叉韧带相近［22］。如果不用特殊方法修饰支架几何结构将影响支架的弹性强度，且支架的刚度会下降。6股钢缆丝纤维基质设计用于满足韧带组织工程的4点重要要求：(1)增强组织浸润率(>90％空隙体积)；(2)增加质量传递；(3)增加表面积有利于细胞黏附和细胞外基质沉积；(4)减小线性刚度以适合天然韧带，避免应力遮挡。
   
　　疲劳试验显示该支架可承受一千万次生理负荷的循环作用。因为丝的高弹性强度和钢缆式设计使基质有足够的空隙容积供体外细胞种植和体内细胞长入。与人前交叉韧带(每当量长度)相比，丝基质只占人前交叉韧带体积的12％(根据长27 mm，直径8 mm前交叉韧带确定)。
   
　　丝支架具有合适的三维培养环境支持细胞黏附和扩散。细胞种植后30 min，扫描电镜观察到细胞很容易黏附于支架。培养1 h后，细胞开始扩散，7 d形成单细胞层，14 d聚集成韧带组织基质。

　　3.3  异基因细胞外基质支架
       
　　细胞外基质是细胞分泌的产物，组织或器官在其基础上形成。细胞外基质的组成和超微结构由影响细胞表型的因素决定，包括力学、生物化学环境、对氧的要求、pH值和固有的基因表达模式。反过来，细胞外基质又影响细胞的生物行为和表型。基质的组成和结构显著影响细胞黏附、增殖和三维排列。
       
　　细胞外基质组成成份是结构和功能蛋白的复杂混合物，氨基葡聚糖、糖蛋白和小分子按照特殊的组织特异性三维结构排列。其成份包括胶原、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、黏多糖及生长因子。天然细胞外基质区别于其它支架的重要特点是其结构和功能蛋白的多样性。细胞外基质内的生物活性分子及其特殊空间分布提供了大量生物信号。
       
　　医用细胞外基质生物材料的制备可将哺乳动物组织和器官做去细胞处理。去除细胞成分就去除了所有与细胞有关的抗原决定簇，此种移植与传统的自体、同种异体和异种基因组织器官移植相比，是明显不同的移植类型。
   
　　去细胞处理的典型方法包括在低渗盐水中广泛漂洗，用稀释的过氧乙酸(0.1％)处理或在Triton 100×中培育，然后用环氧乙烷或γ辐照消毒。这些方法已被证明可完全去除细胞成分，降解<300 bp的核酸碎片，且保留生长因子如bFGF和VEGF的生物活性［28］。
   
　　Cartmell和Dunn［29，30］研究了韧带和肌腱组织去细胞处理的方法。他们比较了磷酸三丁酯(bri(nbutyl)phosphate，TBP)与十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)的去细胞效果。结果用SDS去细胞可达90％，用TBP达84％，所剩细胞集中于韧带骨连接处。韧带去细胞后机械和生化性质无明显改变。与SDS处理韧带相比，经过TBP处理的去细胞韧带更加有利于细胞增殖及长入。
   
　　4  生物反应系统
   
　　组织工程反应器设计用来支持生理浓度的黏附细胞复合于特定支架上及通过增强质量传递来控制环境条件［32］。目前认为正常自体组织存在的机械调节信号(如韧带动力性拉力与扭曲力的结合)对组织形成一定的功能性质必不可少［21，31］。最近研究显示生物反应器提供的动力性负荷对于满足体外组织工程的复杂要求必不可少。
   
　　现在有多种商用生物反应系统。一种应用基质灌流和机械应力生物反应系统被应用于BMSCs组织工程韧带［32］。该生物反应器为韧带组织工程特殊设计，对培养于水凝胶和纤维支架上的BMSCs提供多维机械应力(轴向拉伸／压缩和扭曲力)。生物反应器由电脑控制：(1)由12个单独的反应皿组成，每个反应皿内有一组织工程韧带，且各自有一灌流回路；(2)气体交换器用来控制培养基pH值和氧浓度；(3)12通道振动泵；(4)应力控制系统对韧带行机械刺激。2个生物反应器可同时运作培养24个韧带，如12个施以机械应力，12个作为对照。该生物反应器主要功能包括：(1)对施加机械应力进行精确控制；(2)控制培养基的流速和通路；(3)精确控制培养基中氧浓度和pH值。
   
　　与未经机械刺激的细胞则呈任意方向生长［21］相比，机械刺激诱导细胞顺着力的方向排列，且促进了Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和黏蛋白C的表达。同时，未观察到骨和软骨特异性细胞标记物。重要的是，在没有添加特殊韧带分化诱导物的情况下，张力和扭曲力使BMSCs向韧带细胞方向分化，而没有向其它细胞分化。细胞功能(如增殖率和分化)、韧带结构(如组织成份的量和分布，超微结构组成)、机械行为和韧带特异性标记物的表达随组织培养过程不断变化。这个模型系统能控制系统条件，定量评价环境条件和细胞／组织反应，所以可对体外组织发育进行定量研究。韧带特异性标记物(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和黏蛋白C)转录随着培养时间增加而增加，且经RTPCR测定，在机械刺激组转录水平始终高于无机械刺激韧带。重要的是，机械刺激韧带的细胞和细胞外组织基质是沿应力的方向排列和包围支架的，形成多层组织［2］。
   
　　5  总结
       
　　韧带和肌腱损伤的治疗已经进行了大量研究。无论其自行愈合形成瘢痕组织或用异体移植物、异种移植物都无法达到其功能要求。而自体移植供体部位的并发症又决定了其不可能广泛应用。组织工程为韧带和肌腱损伤的愈合提供了新的治疗途径，其目的是使韧带和肌腱达到功能性再生，达到正常未损伤组织的结构和功能。将来组织工程的研究重点在于具有合适生物结构和机械强度的组织工程支架，并对其表面加以修饰以增强细胞反应；对种子细胞进行基因修饰以加强其细胞外基质的表达；促进组织工程韧带在体内形成接近正常自体韧带的局部条件。随着研究的发展一定会形成新一代组织工程韧带和肌腱并生理性修复韧带和肌腱的损伤。韧带和肌腱组织工程的发展将为韧带和肌腱损伤提供理想的治疗途径。

【参考文献】
  　　［1］ Fu FH, Bennett CH, Lattermann C, et al. Current trends in anterior cruciate ligament reconstruction, part I. Biology and biomechanics of reconstruction［J］. J Sports Med(Am), 1999,27:821-830.

　　［2］ Weitzel PP, Richmond JC, Altman GA, et al. Future direction of the treatment of ACL ruptures［J］. Orthop. Clin. North（Am）, 2002, 33:653-661.

　　［3］ Richmond JC, Manseau CJ, Patz R, et al. Anterior cruciate reconstruction using a dacron ligament prosthesis. A longterm study［J］. Am. J. Sports Med, 1992, 20:24-28.

　　［4］ Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, selfrenewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation［J］. J. Cell. Biochem, 1997, 64:278-294.

　　［5］ Ohgushi H, Caplan Al. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering［J］. J Biomed Mater Res, 1999, 48:913-927.

　　［6］ Turgeman G, Pittman DD, Muller R, et al. Engineered human mesenchymal stem cells: a novel platform for skeletal cell mediated gene therapy ［J］. J Gene Med, 2001, 3:240-251.

　　［7］ Young RG, Butler DL, Weber W, et al. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair［J］. J Orthop Res, 1998,16:406-413.

　　［8］ Obradovic B, Carrier RL, VunjakNovakovic G, et al. Gas exchange is essential for bioreactor cultivation of tissue engineered cartilage［J］. Biotechnol. Bioeng, 1999, 63:197-205.

　　［9］ Fermor B, Urban J, Murray D, et al. Proliferation and collagen synthesis of human ACL cells in vitro: effects of ascorbate2phosphate, dexamethasone and oxygen tension［J］. Cell Biol Int, 1998, 22:635-640.

　　［10］Murray MM, Rice K, Wright R J, et al. The effect of selected growth factors on human anterior cruciate ligament cell interactions with a threedimensional collagenGAG scaffold［J］. J Orthop Res, 2003, 21:238-244.

　　［11］Moreau JE, Chen J, Bramono DS, et al. Growth factor induced fibroblast differentiation from human bone marrow cells in vitro［J］. J Orthop Res, 2005,23:164-174.

　　［12］Attisano L, Wrana JL. Signal transduction by the TGFbeta superfamily［J］. Science, 2002, 296:1646-1647.

　　［13］Lo IK, Marehuk L, Hart DA, et al. Messenger ribonucleic acid levels in disrupted human anterior cruciate ligaments［J］. Clin Orthop Relat Res, 2003, 407:249-258.

　　［14］Marui T, Niyibizi C, Georgescu HI, et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts［J］. J Orthop Res, 1997, 15:18-23.

　　［15］Murakami S, Takayama S, Ikezawa K, et al. Regeneration of periodontal tissues by basic fibroblast growth factor［J］. J Periodontal Res 1999, 34:425-430.

　　［16］Sakai T, Yasuda K, Tohyama H, et al. Effects of combined administration of transforming growth factorbeta 1 and epidermal growth factor on properties of the in situ frozen anterior cruciate ligament in rabbits［J］. J Orthop Res, 2002,20:1345-1351.

　　［17］Jin HJ, Chen J, Karageorgiou V, et al. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats［J］. Biomaterials, 2004, 25:1039-1047.

　　［18］Hankemeier S, Keus M, Zeichen J, et al. Modulation of proliferation and differentiation of human bone marrow stromal cells by fibroblast growth factor 2: potential implications for tissue engineering of tendons and ligaments［J］. Tissue Eng, 2005, 11:41-49.

　　［19］Toyoda T, Matsumoto H, Fujikawa K, et al. Tensile load and the metabolism of anterior cruciate ligament cells［J］. Clin Orthop Relat Res, 1998, 353:247-255.

　　［20］Chiquet M, Matthisson M, Koch M, et al. Regulation of extracellular matix synthesis by mechanical stress［J］. Biochem Cell Biol, 1996, 74:737-744.

　　［21］Altman GH, Horan R, Martin I, et al. Cell differentiation by mechanical stress［J］. FASEB J,2001,16:270-272.

　　［22］Altman GH, Horan RL, Lu HH, et al. Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments［J］. Biomaterials, 2002, 23:4131-4141.

　　［23］ Schaefer D, Martin I, Jundt G, et al. Tissue engineered composites for the repair of large osteochondral defects［J］. Arthritis Rheum, 2002, 46:2524-2534.

　　［24］Pei M, Seidel J, VunjakNovakovic G, et al. Growth factors for sequential cellular deand redifferentiation in tissue engineering［J］. Biochem Bioph Res Commun, 2002,294:149-154.

　　［25］Laffargue P, Frayssinet P, Rtaimate M, et al. Adsorption and release of insulinlike growth factorI on porous tricalcium phosphate implant［J］. J Biomed Mater Res, 2000, 49:415-421.

　　［26］Richardson TP, Peters MC, Ennett AB, et al. Polymeric system for dual growth factor delivery［J］. Nat. Biotechnol, 2001, 19:1029-1034.

　　［27］Lee KY, Peters MC, Anderson KW, et al. Controlled growth factor release from synthetic extracellular matrices［J］. Nature, 2000, 408:998-1000.

　　［28］McDevitt CA, Wildey GM, Cutrone RM. Transforming growth factorb1 in a sterilized tissue derived from the pig small intestine submucosa［J］. J Biomed Mater Res A, 2003，67: 637-640.

　　［29］Cartmell JS, Dunn MG. Effect of chemical treatments on tendon cellularity and mechanical properties［J］. J Biomed Mater Res, 2000, 49:134-140.

　　［30］Cartmell JS, Dunn MG. Development of cell-seeded patellar tendon allograts for anterior cruciate ligament reconstruction［J］. Tissue Eng, 2004, 10:1065-1075.

　　［31］Butler DL, Goldstein SA, Guilak F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics［J］. J. Biomech. Eng, 2000, 122:570-575.

　　［32］Altman GH, Lu HH, Horan RL,et al. Advanced bioreactor with controlled application of multidimensional strain for tissue engineering［J］. J Biomech Eng, 2002, 124:742-749.

作者单位：(第二军医大学附属长征医院骨科，上海 200003)