软骨组织工程强化技术的应用研究△

　　软骨是应用组织工程技术最早构建的组织，其中最具代表性的研究是：1991年Vacanti等［1］用分离的牛关节软骨细胞与可降解的生物材料在裸鼠皮下成功构建出成熟的透明软骨组织。研究组织工程化软骨较多的原因是：软骨组成单一，结构简单，基质中包含软骨细胞这一种细胞，无血管及神经等复杂结构，在构建过程中影响少，便于研究；其次是软骨由于缺少血运，临床上患者软骨缺损后难以自身修复，移植软骨细胞、移植骨与软骨组织等治疗方法虽取得较满意的近期效果，但远期结果组织易塌陷、退变加快，且自体供区取材后较多并发症。因此组织工程化软骨的构建成功不仅有重要的理论创新价值，还具有明显的临床应用前景［２］。软骨组织工程至少包括三个方面的研究内容：种子细胞的获取与扩增、分化增殖；生物材料的选择与构建；合适的修复环境及细胞因子的作用。
   
　　组织工程技术正日益发展，在对软骨缺损的修复中体现出巨大优势。分子生物学、基因克隆、转基因、移植免疫、干细胞、遗传工程、生物材料构建、生物力学、影像学和生物反应器等技术均可被用于组织工程的研究中［３］。利用新措施、新技术促进软骨修复愈合的过程。这些手段可统称为软骨组织工程强化技术(Tissue engineering enhanced technology)，在软骨修复中广泛应用。
   
　　1  生物材料表面修饰技术
   
　　生物支架材料的表面特征及空间结构对细胞行为有一定影响。这具体包括：表面自由能、表面蛋白质吸附能力、表面亲水-疏水平衡、表面荷电性能、表面拓扑结构以及表面活性。透明质酸、蛋白多糖、层黏连蛋白(laminin)和纤维连接素(fibronectin)是与细胞基底膜相接触的主要细胞外基质蛋白，因此常用来与生物材料结合，进行表面修饰。通过在支架材料表面引入某些亲水的化学基团如羟基，可改变材料表面的湿润度，提高材料表面亲水性，增加对细胞的吸附能力。利用细胞外基质蛋白包埋人工合成的支架材料可以提高其生物活性。利用等离子体表面改性技术，能够在高分子材料表面固定生物活性分子，达到促进细胞在材料表面的黏附、生长。目前作为材料表面修饰的蛋白主要是黏附蛋白(或相关肽)和生长因子，随着桥接固定技术的发展和提高，可成为改善生物材料表面活性的关键因素。Cui等［4］用壳聚糖对PLLA膜进行表面修饰后使膜表面变得粗糙，有部分网眼产生，利于软骨细胞增殖和细胞外基质的合成。
   
　　纤维结合素(fibronection,FN)是细胞基质中一种重要的黏附蛋白，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(ArgGlyAsp，RGD)三肽是多种黏附蛋白的功能区，两者可与细胞表面的整合素受体结合，在细胞黏附、增殖、趋向、迁移等方面起着重要作用。可以将FN及RGD三肽通过化学结合的方式引入生物材料表面，可以增强对软骨细胞的黏附能力，并能够促进细胞向支架内部生长。
   
　　常用的材料表面改性方法有表面修饰法、化学改性法、等离子体法、杂化改性法等方式。研究较多的是表面修饰法，即在材料表面固定一些细胞因子或改变材料表面的局部结构特征提高材料的生物相容性。
   
　　2  仿生性生物材料构建
   
　　仿生材料表面工程是指工程化生物材料表面引发特定的细胞生理响应，给细胞创造一个良好的人工胞外基质环境，它要求材料要有良好的生物相容性；适宜的表面亲水-疏水平衡；具有较强的细胞识别功能；可消除非特异性识别；易于加工和成型。
   
　　软骨细胞包埋于致密的基质成分中，模拟正常体内关节软骨基质的成分与结构，无疑会更适合软骨细胞的生长，已有众多研究将软骨基质成分的主要物质或与基质成分相类似的聚合物用于软骨组织工程的构建中。蛋白多糖、透明质酸以及硫酸软骨素是软骨细胞天然的基质成分，壳聚糖、明胶、藻酸盐均具有与这些成分相似的结构，二相、三相甚至四相的生物材料进行复合均获得了成功，合成的新型材料具有更优良的性能，在实验中证实对软骨再生有明显促进作用。
   
　　聚乳酸和壳聚糖均是具有良好生物相容性的组织工程材料。聚乳酸具有良好的机械性能，常用于骨缺失部位的填充治疗。壳聚糖对软骨细胞有很好的亲和及黏附作用。壳聚糖的三维支架结构已经用于和软骨细胞的共同培养中，并显示出促进黏附和生长的作用。但壳聚糖质软、较脆的性质使它在具体临床应用中受到了限制。运用化学方法构建具有双层结构的硬性三维支架，表层为壳聚糖层，深层为聚乳酸层，这样会更符合软骨生理结构的力学特征。可以使不同细胞在不同的材料层中黏附、生长和分化，可以更好的模拟体内关节软骨的真实结构，从而使材料具有以下优点：(1)不同的结构域中具有不同的孔隙，壳聚糖层有良好的促软骨细胞黏附、生长能力，聚乳酸层具有良好的成骨特定移植的材料；(3)可承受一定的压应力，使软骨细胞具有应力刺激作用，产生定向分化作用，从而为关节软骨缺损再生提供更好的治疗手段。
   
　　3  局部药物传递系统
   
　　细胞因子在软骨修复中的作用正逐渐受到重视。多孔生物材料可复合活性蛋白成分，传送到缺损区域，充当局部药物传递系统，能够促进组织工程化软骨的构建过程。该系统具有以下优点：(1)由于生物材料在体内可以降解，载入蛋白量可以通过构建过程中理化因素的改变来调控，因此细胞因子在体内释放具有缓释作用及可控释放效果；(2)细胞因子与材料通过功能基因的配位键结合、容积吸附、表面生成聚电质复合物的形式结合，在体内被释放前，能够受到材料对自身的保护作用，保持一定的生物活性；(3)局部传递药物，可以降低生物蛋白对机体其它器官的影响，增加局部药物浓度，减少全身蛋白的用量；(4)作用靶细胞明确，细胞因子可以避免全身用药时的过多降解，剂量及作用时间具有可调控性。
   
　　软骨组织工程中常用壳聚糖的缓释系统，包括与支架材料直接复合、制备成微球、微囊结构包裹、形成珠状凝胶等方式。Park等［5］利用冷冻干燥的方法制备孔径在150～200 μm的壳聚糖-硫酸软骨素海绵样支架材料，通过浸泡的方式吸附血小板源性生长因子BB。研究发现生长因子的释放可以调控，释放速度主要受材料中硫酸软骨素含量的多少及材料表面积的影响。
   
　　4  基因活性材料的应用
   
　　阳离子聚合物具有与DNA相结合的能力，可以充当局部基因传递的载体，在软骨缺损区域表达活性的治疗因子，能够促进修复过程。在对软骨的修复治疗中，基因活化材料(geneactivated matrices, GAM)正体现出巨大治疗优势。它不仅可以充当组织工程中细胞生长支架，为种子细胞提供生长、增殖的场所和空间，材料本身作为基因成分的传递载体，还可以完成治疗基因的局部传送。材料内的种子细胞或周边组织细胞可以捕获到释放出来的基因成分，或黏附在吸附有质粒DNA的材料表面。细胞通过内吞方式获取治疗基因片段，充当局部生物反应器，表达、合成治疗因子，以自分泌及旁分泌的方式作用于周围细胞。Guo等［6］利用壳聚糖和明胶合成三维支架材料，然后载入含转化生长因子-β１的基因片段，体外与软骨细胞共培养时发现具有促进软骨细胞增殖、分化及分泌特异性基质的功能。
   
　　应用GAM修复软骨缺损具有以下优势：(1)关节腔内直接应用，可以提高基因成分的利用率，避免基因成分被机体循环系统内核酸酶过多降解，利于局部形成高浓度的DNA含量，并可避免异位转染，安全性相对较高；(2)软骨缺损区的修复细胞比较单一，直接在GAM内获取基因成分，具有靶向性，符合靶向给药系统(targeting drug system,TDS)与靶细胞的作用时间，治疗效果可以明显提高；(3)关节软骨组织缺少血运，难以从血液循环系统中获得大剂量的细胞因子，GAM在满足软骨细胞、骨髓基质干细胞黏附增殖以及分化的基础上，所携带的基因成分在局部表达，分泌高活性的治疗因子，能够促进修复过程；(4)软骨修复只是一个阶段性过程而不需要长期的基因产物表达，GAM中的DNA具有一定的释放动力学，能够满足对生长因子治疗时间窗的要求，避免了过多剂量的DNA使用［8］；(5)可同时复合多种治疗因子基因，对软骨缺损修复起到协同作用。
   
　　5  种子细胞培养扩增技术
   
　　生物反应器的应用为软骨体外构建提供了便利条件，因为可模拟软骨在体内的生长环境，提供所必需的应力刺激。应用生物反应器培养至少有3个优点［9］：(1)特殊的液体流动方式有助于提高细胞在三维支架上的空间分布一致性；(2)有助于提高生物大分子的运输效率，使营养交换和物质传递处于动态的平衡状态；(3)在软骨形成过程中提供应力刺激。目前较常用的生物反应器有：搅拌式生物反应器系统、灌注式生物反应器系统、同心桶型生物反应器以及旋转的微重力生物反应器系统。
   
　　在软骨组织工程的研究中，生物反应器的设计是一项复杂的系统工程，设计中要充分考虑到细胞、组织能进行有效的培养，这需要工程学和生物学等多学科的协作。在设计中，要充分考虑到生物培养中各方面的影响因素，如种子细胞生长条件、收获时间、细胞扩增、存储和灭菌消毒等各种问题。
  
　　6  干细胞诱导分化技术
   
　　干细胞是软骨组织工程最为理想的种子细胞。骨髓间充质干细胞因具有获取容易、体外扩增能力强、自我更新快、多向分化潜能的特点，成为研究较多的干细胞。运用骨髓间充质干细胞的优势是［10～13］：(1)因其能迅速扩增，并能保持分化能力，故所需的细胞数量低；(2)获取细胞的操作简单，损伤小；(3)得到的工程软骨可以避免免疫排斥反应；(4)条件适合时，间充质细胞可同时向骨和软骨方向分化，既可修复关节软骨面的缺损，也可修复软骨下骨的缺损；(5)虽然它占整个骨髓单核细胞总数的比例随着年龄的增长而逐渐下降，但在体外培养的条件下其自我增殖和多向分化的能力，以及基质合成的能力基本保持不变。有很多技术可以促进干细胞的诱导分化过程：应用转基因技术将诱导因子基因转入干细胞，使其能够以自分泌及旁分泌的方式促进诱导定向分化过程；模拟软骨生长微环境技术，可以促进干细胞向软骨分化；利用生物材料本身的结构与成分特性来促进干细胞分化过程。
   
　　组织工程是新兴发展的科学，越来越多的技术将会应用到组织创伤的修复过程中［14］。随着材料生产工艺的改进及规模化生产、种子细胞库的建立与管理正规化、动物体内实验结果评估的细致化实施，组织工程技术将会为众多临床关节软骨缺损患者带来治疗希望。

【参考文献】
  　　［1］ Vacanti CA, Langer R, Schloo B, et al．Synthetic polymers seeded with chondrocyted provide a template for new cartilage formation［J］．Plastic Reconstruct Surgery, 1991,88:753-759.

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　　［3］ Steven AG, Maria RM.Current concepts in tissue engineering:cell, matrices, and genes［J］. Current Opinion in Orthopaedics,2001,12:424-427.

　　［4］ Cui YL, Qi AD,Liu WG,et al.Biomimitic surface modification of poly(Llacid) with chitosan and its effects on articular chondrocyted in vitro［J］. Biomaterials,2003,24:3859-3868．

　　［5］ Park YJ, Lee YM,Lee JY,et al.Controlled release of plateletderived growth factorBB form chondroitin sulfatechitosan sponge for guided bone regeneration［J］.J Control Release,2000,67:385-394.

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　　［10］VanDamme A, Drissche T,Collen D, et al. Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy［J］. Current Gene Therapy,2002,2(2):195-209.

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　　［14］Griffith LG, Naughton G.Tissue engineering:current challenges and expanding opportunities［J］.Science,2002,295(5557):1009-1014.


△全军“十一五”重点攻关项目(06G043)
△江苏省自然科学基金面上项目资助项目(BK2005085)

作者单位：南京军区南京总医院骨科，南京 210002