骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究△

【摘要】  ［目的］观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。［方法］将速固化壳聚糖磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72 h首次换液，细胞融合80%传代，取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养，分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。［结果］用酶标仪检测OD值提示共培养后，支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构，孔内见有细胞生长，细胞表面可见分泌颗粒。［结论］速固化壳聚糖磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性，细胞可在材料内黏附和增殖，是理想的骨组织工程支架材料。

【关键词】  磷酸钙； 壳聚糖； 骨髓间充质细胞； 组织工程； 体外培养

　　组织工程是将大量细胞三维有序化构成组织，而支架材料是使细胞有序化三维排列所必需的载体。在骨组织工程支架材料中，磷酸钙骨水泥因具有易塑形和可注射等特点而成为目前研究的热点〔1〕。而经过近年来的强韧化和速固化等改性处理后，磷酸钙骨水泥在临床上应用将更具实用性。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有强大的增殖和多向分化能力而成为目前组织工程研究中最常用的种子细胞来源。本研究观察新型速固化壳聚糖磷酸钙骨水泥支架材料与成人MSCs细胞共培养后，材料对细胞黏附和增殖的影响，以评价该材料的细胞相容性。
   
　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂和仪器
   
　　DMEMLG培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（天津TBD公司），地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸（Sigma公司），四甲基偶氮唑蓝MTT、二甲基亚砜DMSO、乙二胺四乙酸EDTA（Amresco公司），680型酶标仪（美国BIORAD公司），XL30ESEM扫描电镜（PHILIPS公司）。
   
　　1.2  方法
   
　　1.2.1  壳聚糖磷酸钙骨水泥的制备
   
　　将主要成分为壳聚糖溶液（脱乙酰度为93%，分子量约942 000）的液相及固相的磷酸三钙粉末（均由暨南大学理工学院材料科学与工程学院提供）用γ射线消毒备用。在室温下，将固相和液相以0.7 g：1 ml比例置于培养皿内混合，搅拌均匀成糊状后，置于模具中成形。约5 min后材料基本凝固，失去流动性。
   
　　1.2.2  成人MSCs细胞培养
   
　　从年轻健康志愿者髂前上棘处抽取肝素化骨髓约3 ml，采用全骨髓分离培养法。细胞生长至瓶底约90%面积时，按1：3进行传代培养。取第3代人骨髓MSCs细胞用于实验。
   
　　1.2.3  细胞与支架材料复合培养
   
　　材料预湿：将成形材料置于6孔培养板上，浸于完全培养基中预湿1 h。
   
　　细胞准备:将第3代人骨髓MSCs用0.25%胰酶消化，制成1.0×106个／ml的细胞悬液。
   
　　细胞与材料联合培养：采用沉淀法接种细胞。将200 μl细胞悬液滴于材料上，将6孔板置于培养箱中，接种3 h后，加入完全培养基并使之完全浸泡材料。之后每3 d换液1次。
   
　　1.2.4  MSCs在支架材料中的活力检测（MTT法）
   
　　用MTT法检测细胞在材料中的增殖情况。将细胞与材料共培养后第1 d起，隔天取一材料，用PBS冲洗后，0.25%胰酶及0.02%EDTA消化材料中的细胞，收集细胞，加入孔板中。加入MTT 10 μl，37 ℃温育4 h，加入100 μl DMSO，在酶标仪上560 nm处测定OD值。
   
　　1.2.5  组织工程材料扫描电镜（SEM）分析
   
　　在细胞-材料共培养1周后用扫描电镜进行观察。将标本经PBS清洗后，置于体积分数为2.5%戊二醛溶液中固定过夜，30%～100%梯度酒精脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥、喷金，用PHILIPS XL30ESEM扫描电镜观察。
   
　　2  结果
   
　　2.1  成人骨髓MSCs培养光镜观察
   
　　原代72 h首次换液后，可见部分细胞贴壁，细胞呈圆形、椭圆形或梭形。多数细胞呈集落样生长，边缘细胞为梭形。散在细胞多为梭形，体积较大。3周左右，细胞融合可达瓶底面积约90%。这时细胞成簇状或旋涡状生长，细胞多为细短的梭形。传代24 h后，大部分细胞贴壁，少量悬浮细胞在换液时去除。5～7 d，细胞融合可达瓶底面积约90%，细胞为长梭形，形态均一（图1）。
   
　　2.2  成人骨髓MSCs在支架材料中的活力检测
   
　　活细胞线粒体脱氢酶能将MTT还原成甲臢（formazan）。甲臢为紫色结晶，可溶于DMSO。用酶标仪在560 nm波长处测定其OD值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲臢结晶物形成的量与细胞数成正比。本实验通过MTT法检测显示细胞与支架联合培养后，细胞在材料中具有增殖活力（图2）。

　　图1第3代人骨髓间充质干细胞  （100×）（略）

　　图2细胞在材料中的增殖情况（略）

　　2.3  SEM观察细胞与材料复合生长情况
   
　　扫描电镜（SEM）图像显示人骨髓MSCs与速固化磷酸钙支架共培养7 d时细胞在多孔支架材料上生长情况（图3）。图中可见材料内部为多孔结构，且其孔径较大，超过100 μm。孔内可见细胞生长，细胞呈纺锤形，细胞表面有分泌颗粒。

　　图3SEM观察细胞与材料复合生长情况（略）

　　3  讨论
   
　　良好的细胞及组织相容性是医用生物支架材料应首先具备的基本条件。羟基磷灰石与人类骨骼中的无机盐具有十分相似的化学组成，具有良好的组织相容性、骨传导和骨诱导性能，是目前临床上最理想的骨植入材料之一。然而，目前所使用的羟基磷灰石多为经煅烧成形后的固态材料，不易塑形，给临床应用造成不便。而近年来出现的磷酸钙骨水泥（Calcium Phosphate Cement，CPC）具有可塑形的优点，可填充各种复杂形状的骨缺损，而其固化后的产物为羟基磷灰石〔2〕。不过，早期研制的磷酸钙骨水泥普遍存在固化时间长〔3〕和力学强度不足〔4〕等缺点，使其在使用时容易被局部组织出血冲去而无法原位固化且不宜用于人体负重部位。因此要将磷酸钙骨水泥在临床上推广应用，对材料改性使其强韧化并可迅速固化便成为目前需要解决的问题。
   
　　针对上述问题，许多学者对磷酸钙骨水泥进行了改性研究。Takagi等〔5〕的研究发现，在骨水泥液相中加入壳聚糖（Chitosan）可以缩短其固化时间。而最近新研制的壳聚糖磷酸钙骨水泥的固化时间减少到了6.7 min〔6〕。在国内也有研究发现，磷酸钙壳聚糖复合物在潮湿条件下更稳定，固化时间缩短，抗压强度提高〔7〕。壳聚糖（Chitosan）是一种带正电荷的碱性多糖聚合物，它具有生物相容性好、无毒、可降解和抗菌等优点。壳聚糖分子表面带有亲水的功能基团，使其便于细胞黏附〔8〕。而且壳聚糖还具有促进成骨和基质矿化的作用〔9〕。本实验所用的磷酸钙骨水泥其液相主要成分是壳聚糖。将具有良好组织相容性的壳聚糖引入磷酸钙骨水泥组分中，从理论上说该复合材料的组织相容性应该是令人满意的。而本实验的结果也证实了作者的预测。从实验中MTT法检测结果可以看出，骨髓MSCs细胞在材料中保持增殖活力。而电镜扫描图像也显示，支架内部为多孔结构，且有许多孔径超过了100 μm。这对细胞长入、工程化组织在体内的物质交换以及骨的再生都是有利的〔10〕。从电镜图中还可以看到，在材料内部孔隙中有细胞的长入，且细胞表面出现分泌颗粒，这反映了孔隙中长入的细胞具有代谢功能。从上面的实验结果可以看出，该支架材料对细胞具有良好的亲和性，细胞在材料内可发挥功能。
   
　　综上所述，该新型速固化磷酸钙骨水泥支架材料具有良好的细胞相容性，且材料内部的多孔结构和孔径也能满足于细胞长入和骨的再生，是构建骨组织工程的理想材料。
   

【参考文献】
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　　〔5〕 Takagi S,Chow LC,Hirayama S,et al.Properties of elastomeric calcium phosphate cementchitosan composites［J］.Dent Mater,2003,19（8）:797804.

　　〔6〕 Xu HH,Takagi S,Quinn JB,et al.Fastsetting calcium phosphate scaffolds with tailored macropore formation rates for bone regeneration［J］.J Biomed Mater Res（Am）,2004,68:725734.

　　〔7〕 潘朝晖，范清宇，蔡和平，等.壳聚糖对自制磷酸钙骨水泥性能的影响［J］.第四军医大学学报，2005,26（5）:19811984.

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　　〔9〕 Seol Y J,Lee JY,Park Y J,et al.Chitosan sponges as tissue engineering scaffolds for bone formation［J］.Biotechnol Lett,2004,26（13）:10371041.

　　〔10〕 Tamai N,Myoui A,Tomita T, et al.Novel hydroxyapatite ceramics with an interconnective porous structure exhibit superior osteoconduction in vivo［J］.J Biomed Mater Res,2002,59（1）:110117.

作者单位：暨南大学医学院血液研究所，广州 510632；暨南大学理工学院材料科学与工程学院，广州 510632