骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系

【摘要】  ［目的］探讨骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体（A recombinant adenoviral vector carrying the human BMP2 gene,AdBMP2）在成骨过程中和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）相互关系。［方法］应用人骨形态发生蛋白2腺病毒载体体外感染兔骨髓间质干细胞（bone marrow stem cells,BMSC），感染后观察BMP2、VEGF和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达及钙结节形成。同时将30 μl AdBMP2行裸鼠左后肢肌组织内注射，术后20 d取材，免疫组化和原位杂交法观察BMP2与VEGF体内表达情况。30 μl β半乳糖苷酶腺病毒载体（Ad β gal）右后肢肌内注射作为对照。［结果］BMSC被AdBMP2感染后，向成骨细胞分化，上调VEGF的表达。在体内成骨过程中，BMP2在软骨细胞、成骨细胞和再生骨组织周围单核细胞表达阳性，VEGF在软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞均表达阳性。［结论］BMP2和VEGF两者协调一致，互为促进，完成了骨组织的发生。

【关键词】  腺病毒; 骨形态发生蛋白; 血管内皮细胞生长因子; 基因

　　VEGF是主要促进血管再生的生长因子，在软骨化骨的再生过程中，发挥着重要的作用，BMP2是目前成骨活性明确的诱导因子。但是，由AdBMP2引起的骨组织再生过程中，VEGF所起的作用以及VEGF和BMP2两者间的相互关系却知之甚少。本研究将hBMP2基因导入到兔BMSC，分析基因感染后BMP2对细胞分化和VEGF表达的影响。同时，又将AdBMP2直接注射到裸鼠肌组织内，探讨VEGF在AdBMP2启动的骨组织再生过程中所起的作用及VEGF和BMP2两者间的相互关系，为进一步应用基因技术构建血管化的组织工程骨奠定基础。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  实验材料
   
　　1.1.1  腺病毒载体和细胞株
   
　　人骨形态发生蛋白腺病毒表达载体（AdBMP2）为E1、E3区缺失的5型重组腺病毒载体，由美国哈佛医学院分子骨科中心Oliver博士馈赠。携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（Ad β gal）和人胚肾细胞株（293细胞）由吉林大学白求恩基础医学院病理教研室高航博士馈赠。
   
　　1.1.2  主要试剂
   
　　DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone）。BMP2和VEGF多克隆抗体和原位杂交检测试剂盒（博士德公司）。Xgal（大连宝生物）。ALP试剂盒（上海虹桥医用试剂研究所）。
   
　　1.1.3  实验动物
   
　　BALB/c裸鼠（20～25 g，雌雄不限，中国医学科学院动物所）。
   
　　1.2  实验方法
   
　　1.2.1  AdBMP2重组腺病毒表达载体扩增、纯化
   
　　将AdBMP2感染293细胞，待细胞完全出现病变（CPE）后，反复冻融3次，收集溶解产物和细胞，4 ℃ 12 000 r/min×10 min离心取上清收获病毒。氯化铯密度梯度离心法纯化，空斑形成单位测定病毒滴度（PFU）。-70 ℃保存备用。
   
　　1.2.2  兔BMSC的培养
   
　　健康日本大耳白兔，（2.0±0.5）kg，3％戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔麻醉。骨髓穿刺针接10 ml注射器，内含稀释的肝素钠2 500U/ml约0.5 ml，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液2～3 ml，2 ml PBS混匀，注入含有4 ml淋巴细胞分层液的试管内，密度梯度离心，1 500 r/min离心15 min，吸取中间单核细胞层，PBS洗2次，以2×104 /cm2的密度接种于50 ml培养瓶内，加含10%胎牛血清DMEM培养液5 ml。在5%CO2孵箱内37 ℃培养4 d，更换培养液时将未贴壁的细胞全部弃掉,继续培养且每周换液2次。12～14 d后基本长满单层,用0.25%胰酶消化，以1×104 /cm2的密度传代培养。
   
　　1.2.3  AdBMP2感染BMSC
   
　　BMSC按1×104/孔的密度接种于24孔培养板，待细胞长至近60%融合时，更换为2%胎牛血清DMEM培养液，根据计数的细胞数加入AdBMP2（MOI为100），过夜，次日晨更换5%胎牛血清DMEM培养液继续培养。Ad β gal同等条件下感染检测感染效率。
   
　　1.2.4  AdBMP2裸鼠体内注射
   
　　使用2％戊巴比妥钠0.1 ml/只麻醉。双后肢消毒后，微量注射器抽取30 μl AdBMP2（6×108病毒颗粒）于4只裸鼠左后肢近膝关节肌组织内处注射，再抽取30 μl Ad β gal（6×108病毒颗粒）于裸鼠右后肢近膝关节处注射，作为对照。
   
　　1.2.5  感染后BMSC成骨分化
   
　　细胞感染后3 d，采用RTPCR方法观察hBMP2的mRNA表达，7 d后采用ALP染色试剂盒观察ALP的表达。感染后21 d，茜素红染色显示钙结节，未感染细胞和Ad β gal感染组细胞作为对照。
   
　　1.2.6  检测感染后细胞VEGF的表达
  
　　细胞爬片、感染后7 d，固定，采用免疫组织化学染色方法观察VEGF的表达情况，未感染细胞作为空白对照。然后利用图像分析系统计数每组细胞中VEGF的平均染色灰度值，以确定细胞中VEGF的相对含量。数据采用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，均数±标准差表示，t检验检测（P＜0.05有显著性差异）。
   
　　1.2.7  检测注射处组织hBMP2和VEGF表达
   
　　注射后20 d，麻药过量致死，于注射处取材，4%多聚甲醛（含0.1%DEPC）固定样本，EDTA脱钙，常规制片。原位杂交法和免疫组化法检测注射处组织hBMP2和VEGF表达。
    　　
　　2  结果
   
　　2.1  重组腺病毒载体滴度测定
   
　　重组腺病毒可以在覆盖到293细胞的琼脂糖平板上形成噬菌斑。通过感染293细胞扩增重组病毒及纯化后，测得AdBMP2滴度为2×1010 pfu/ml。
   
　　2.2  BMSC培养
   
　　原代BMSC接种后在培养瓶底散在分布，梭形。7 d细胞形成集落状，长梭形，此后细胞集落融合成片，呈旋涡状排列，12～14 d传代，传代后细胞呈纺锤形，散在均匀分布，不再集落样生长，3 d左右长满瓶底。
   
　　2.3  BMSC感染后向成骨细胞分化
   
　　βactin作为标准化内参，hBMP2 mRNA在AdBMP2感染后3 d开始表达，而对照细胞则为阴性（图1）。ALP染色显示感染后7 d细胞呈红色阳性着色（图2），而对照组细胞阴性。茜素红染色显示感染后21 d红色钙结节形成（图3），对照组则为阴性。
 
　　图1aβactin 180bp 26个循环（略） 

　　图1bhBMP2 339 bp 30个循环；1为未经处理细胞；2为感染Ad β gal细胞；3为感染AdBMP2细胞 （略）

　　图2转染细胞7 d后ALP染色细胞呈红色阳性着色  （×40）（略） 

　　图3转染后细胞21 d茜素红染色，显示钙结节  （×40）（略）

　　2.4  感染后细胞VEGF表达的测定
   
　　免疫组化法检测AdBMP2感染BMSC，见绿色阳性颗粒出现分布于细胞质及胞膜，胞核阴性（图4）。未感染组少见绿色荧光颗粒。原位杂交法检测AdBMP2感染的细胞中VEGF的表达较对照组明显增高，测得灰度值为实验组（152.55±4.18），对照组（164.58±4.44）（x-±s，n=20），P＜0.01。

　　图4转染细胞7 d后免疫组化法检测VEGF，显示胞浆中绿色荧光颗粒（×100）（略）

　　2.5  注射处组织hBMP2的检测结果
   
　　组织学可见注射处肌组织内有多个软骨岛形成，其周边可见大量的单核间质细胞聚集，软骨岛中出现不规则的溶解区，出现钙化并有少量编织骨形成，可见成熟的骨组织和骨陷窝，成骨细胞活跃附于骨小梁壁上，骨细胞分布无规律，体积较大，形状不规则。免疫组化法检测新生软骨组织中软骨细胞，周围的前成骨细胞、单核间质细胞以及毗邻肌束出现棕黄色阳性着色（图5）

　　图5AdBMP2注射后20 d，hBMP2免疫组织化学观察到新生软骨组织中软骨细胞、单核间质细胞以及毗邻肌束出现棕黄色阳性着色  （×100）（略）

　　2.6  注射处组织VEGF的检测结果
   
　　观察到肌纤维间单核间质细胞，骨小梁周围和小血管内皮细胞出现较强的棕黄色阳性着色（图6）。

　　图6原位杂交标记VEGF的表达。观察到软骨岛溶解区出现较强的棕黄色阳性着色  （×100）（略）

　　3  讨论
   
　　BMSC位于骨髓的基质细胞系中，容易分离，分裂增殖能力强，经AdBMP2感染后外源基因表达稳定，并分化为成骨细胞，是基因治疗的理想靶细胞之一〔1〕。VEGF是主要促进血管再生的生长因子，其作用于血管内皮细胞表面的相应受体上，一方面可以促进内皮细胞增殖、迁移；另一方面增加局部毛细血管通透性，使纤维蛋白原渗出，于周边形成凝胶样基质，可支持并诱导毛细血管长入〔2〕。在本实验中，采用了兔BMSC作为AdBMP2感染的靶细胞，结果表明，BMP2感染使BMSC向成骨细胞分化并上调了VEGF的表达，可见BMP2在体外进一步促进了成骨细胞分泌VEGF。
   
　　在体内实验部分，AdBMP2注射后20 d,在肌纤维间隙大量趋化而至的单核细胞，软骨岛溶解区基质及内部的软骨细胞，类骨质周围成骨细胞和小血管内皮细胞出现较强的BMP2和VEGF棕黄色阳性杂交信号，而新生骨组织或软骨化骨部位，有大量小血管出现，可见VEGF的表达部位是和血管发生部位相一致的，“成骨-VEGF表达-血管发生”是一个密切相互关联的过程。这与骨组织发生这一生理过程的要求是一致的，无论膜内成骨、软骨成骨或骨折愈合均与血管有着密切的关系。血液一方面可以带来各种细胞存活所必需的养分和运走组织的代谢废物，另一方面，随血流可以运来大量的细胞因子和具有各种功能的细胞（包括多向分化潜能的间质干细胞），它们相互协同共同完成骨组织再生这样一个复杂的生理过程。VEGF是主要的促进血管再生的生长因子，可以促进血管内皮细胞增殖、迁移并诱导毛细血管长入。Martine等〔3〕发现降低VEGF可以抑制骨形成，而增加VEGF的含量则明显促进骨形成，骨岛形成数目明显增多。可见，VEGF在血管发生过程中可通过调节局部血管网的形成调节血供，从而调节骨形成。Deckers等〔4〕的研究结果更加明确了这一点，他们用BMP2、BMP4和BMP6作用于大鼠的成骨前体样细胞，不仅可以增高其骨钙素mRNA的合成，同时也增加其VEGF的分泌量，可见，BMP2可以使成骨样细胞VEGF高表达而刺激骨块的血管生成，VEGF的产生与微环境中BMP2的浓度呈正相关。Bouletreau等〔5〕的研究结果认为在低氧和（或）VEGF存在的环境下，血管内皮细胞均明显上调了BMP2的表达。Yao等〔6〕等实验结果表明，大鼠通过运动锻炼获得的骨量增加是和骨组织内VEGF及其受体的上调表达是协调一致的。可见，BMP和VEGF之间存在着相互协同的级联放大作用，两者相互协调共同完成骨发生这一复杂的生理过程，但两者之间是直接相互作用还是通过其他调节步骤来完成的，还需进一步研究和探讨。
   
　　VEGF对于构建组织工程骨修复骨损伤是有重要意义的，因为VEGF可以诱导毛细血管生长，血管快速长入可以加速重建组织工程骨的血管网络，组织工程骨血管化后变成活骨才能从根本起到加速骨愈合的作用，因此，构建血管化组织工程骨将是今后的努力方向。
   

【参考文献】
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　　〔3〕 Martine ML,Deckers,Marcel K,et al.Expression of vascular endothelial growth factors and their receptors during osteoblast differentiation［J］.Endocrinology,2000,141:1667.

　　〔4〕 Deckers MM,Bezooijen RL,Horst G,et al.Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblastderived vascular endothelial growth factor A［J］.Endocrinology,2002,143（4）:15451553.

　　〔5〕 Bouletreau PJ,Warren SM,Spector JA,et al.Hypoxia and VEGF upregulate BMP2 mRNA and protein expression in microvascular endothelial cells:implications for fracture healing［J］.Plast Reconstr Surg,2002,109（7）:23842397.

　　〔6〕 Yao Z,LafageProust MH,Plouet J,et al.Increase of both angiogenesis and bone mass in response to exercise depends on VEGF［J］.J Bone Miner Res,2004,19:14711480.

作者单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海 200011；吉林大学中日联谊医院手外科,长春 130031；中国医科大学附属第二医院骨科，沈阳 110003