多西紫杉醇联合顺铂在人骨肉瘤化疗中的作用△

【摘要】  ［目的］研究多西紫杉醇联合顺铂对人骨肉瘤细胞的增殖抑制及在骨肉瘤化疗中的作用。［方法］应用细胞计数、形态学观察、流式细胞术等方法检测和观察分别及联合应用多西紫杉醇和顺铂对人骨肉瘤细胞株的增殖抑制；建立裸鼠荷人骨肉瘤动物模型，分别及联合应用多西紫杉醇和顺铂对其进行治疗，并设立空白对照。观察瘤体的生长及病理指标。［结果］多西紫杉醇和顺铂分别及联合用药，在一定范围内均对骨肉瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用，并且联合用药组作用明显强于单独用药组，抑制率≥59.34%（P＜0.05；），凋亡率18.31%（P＜0.01）。多西紫杉醇和顺铂单独应用均可抑制骨肉瘤瘤体的生长，肿瘤抑制指数分别为84.16%、78.53%；两者联合应用时作用更为明显，肿瘤抑制指数为96.78%。［结论］多西紫杉醇和顺铂联合用药比单独用药对骨肉瘤细胞株增殖抑制作用更强，在骨肉瘤化疗中的作用更强。

【关键词】  多西紫杉醇； 骨肉瘤； 裸鼠； 凋亡

　　骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，好发于青少年。多西紫杉醇（docetaxel，TXT）是一种新型广谱抗肿瘤药物，可治疗多种晚期癌症如肺癌、胃癌和卵巢癌等〔1、2〕，但对骨肉瘤的治疗研究文献报道较少。本研究从体内、体外试验两方面研究多西紫杉对人骨肉瘤细胞株HOS-8603的增殖抑制效果及在荷人骨肉瘤裸小鼠化疗中的作用，为多西紫杉醇用于临床骨肉瘤的治疗提供理论依据。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  细胞及培养条件
   
　　人骨肉瘤细胞HOS-8603引自中国医学科学院药物研究所，培养于含10％的胎牛血清，DMEM培养基中，培养箱37 ℃含5％CO2，以108／L细胞接种，24 h后加多西紫杉醇和顺铂至所需浓度，每24 h换液1次，并为相应浓度的药物设立对照组。
   
　　1.2  药物和试剂
   
　　多西紫杉醇和顺铂均购于齐鲁制药厂，储存于-20 ℃。噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）等购于华美生物公司。

　　1.3  细胞形态观察
   
　　细胞经药物处理后，继续孵育24、48 h，在倒置相差显微镜下观察并照相。
   
　　1.4  MTT法检测
   
　　将2.0×106／L细胞接种于96孔培养板，每孔200 μl；贴壁后加不同浓度多西紫杉醇，顺铂及联合组处理，每种浓度平行3孔，并设立空白对照组。培养箱内分别培养24、48 h，每孔加20 μl新配制的5 g/L MTT，37 ℃继续孵育4 h，弃上清后加150 μl DMSO溶解，振荡至沉淀完全溶解，用全自动荧光酶标仪在490 nm波长测定吸光度（A），计算肿瘤细胞抑制率：肿瘤细胞抑制率=（1-实验孔测定值/对照孔测定值）×100％。
   
　　1.5  流式细胞仪分析
   
　　药物处理24 h后，收集细胞（1～5）×106个，1 000 r／min离心5 min，弃去培养液，PBS 1 ml洗2次，离心，加入冰预冷的70％乙醇固定，4 ℃过夜；离心弃去固定液，加入PI染液1 ml，于4 ℃避光染色30 min，400目尼龙网过滤，用流式细胞仪检测凋亡率。
   
　　1.6  动物模型的建立
  
　　将液氮冻存的HOS-8603人体骨肉瘤细胞株复苏，于CO2孵箱扩增培养。取裸鼠（BALB／c-nu／nu）20只，4周龄，雌雄不拘，于恒温（24～26 ℃）普通无菌室内超静生物层流架饲养，无菌操作。于每只裸鼠臀部皮下注入等体积细胞悬液，接种的细胞数为1×107个/只，4～5 d后均可形成瘤体。
   
　　1.7  裸鼠分组及用药
   
　　1.7.1  分组
   
　　将形成骨肉瘤体的20只裸鼠分为4组，每组5只。A组单纯予顺铂治疗，B组单纯予多西紫杉醇治疗，C组予多西紫杉醇及顺铂联合治疗，D组予等体积生理盐水注射作为空白对照。
   
　　1.7.2  给药方式及剂量
   
　　A、B、C、D 4组均经鼠尾静脉给药，给药剂量均为：多西紫杉醇20 μg／g，顺铂10 μg／g,分别在裸鼠成瘤后第1、7、14、21 d给药，共4次。
   
　　1.8  疗效观察
   
　　1.8.1  大体观察
   
　　每天观察裸鼠的精神状态、饮食及活动灵敏度等一般状况，定期测量裸鼠的体重及肿瘤大小。肿瘤体积按以下公式计算：体积（V）=长×宽2×0.2；计算肿瘤抑制指数（I.I）=（V对照组-V实验组）/V对照组×100％。
   
　　1.8.2  血涂片
   
　　治疗结束后自裸鼠眼眶活体取血作血涂片，镜检。
   
　　1.8.3  骨髓涂片
   
　　治疗结束后自裸鼠股骨骨髓腔活体取骨髓作骨髓涂片，镜检。
   
　　1.8.4  重要器官的检查
   
　　解剖取肝、脾、肺、肾，甲醛固定后作蜡块包埋、切片，行苏木精-伊红（HE）染色，镜检。
   
　　1.8.5  肿瘤的常规病理检查
   
　　取肿瘤精确测量其长短径，甲醛固定后作蜡块包埋、切片，行苏木精-伊红（HE）染色，镜检。
   
　　1.9  统计学处理
   
　　计量资料用均数±标准差（x-±s）表示，应用SPSS 11.5统计软件，采用单因素方差分析及多个样本均数间的两两比较分析。
   
　　2  结果
   
　　2.1  形态学观察
   
　　在倒置显微镜下，空白组细胞呈多角形、纺锤形，核呈圆形，细胞贴壁生长良好、密集（图1）。单用多西紫杉醇及顺铂时细胞多为菱形或不规则形，表现出不同程度的细胞皱缩，边缘毛糙，部分细胞核染色质固缩，聚集于核边，胞浆浓缩，部分可出现由核碎裂形成的凋亡小体（图2），部分圆形细胞脱落而悬浮于培养液中。二者合用时可见细胞凋亡数进一步增加，大量细胞脱落悬浮于培养液中，只剩少数细胞贴壁（图3）。以上改变随着药物作用时间的延长而愈趋显著。
   
　　2.2  多西紫杉醇和顺铂对骨肉瘤细胞的生长抑制作用
   
　　各组药物分别作用24、48 h后，对HOS-8603细胞生长抑制作用见表1，表明：（1）细胞存活率与药物浓度呈反比，且有明显的剂量依赖性。（2）随着时间的延长，药物的敏感性增加，同一剂量的药物有时间依赖关系。（3）以10 μg／ml浓度多西紫杉醇协同8 μg／ml浓度顺铂作用24、48 h组最为显著，抑制率分别为（69.74±5.66）％、（78.18±7.44）％，与相应浓度单药作用组比较P＜0.01。

　　表1  多西紫杉醇（DTX）和顺铂（CDDP）对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用（略）

　　2.3  细胞周期及DNA含量的变化
   
　　流式细胞仪定量检测细胞凋亡比例，结果见表2。2、3、4组分别与1组比较差异均有显著性意义（P＜0.01）；2、3组与4组比较差异有显著性意义（P＜0.01）；3组与2组比较差异亦有显著性意义（P＜0.01）。
　
　　表2  流式细胞术检测药物对骨肉瘤细胞的凋亡率（略）

　　*P＜0.01,vs Control group;#P＜0.01,vs DTX+CDDP group。

　　2.4  一般情况
    　　
　　治疗开始前，各组裸鼠体重变化的差异无显著性，治疗开始后，行多西紫杉醇治疗的A、C 2组裸鼠精神状态逐渐萎靡，活动减少，进食饮水量较前减少，体重减轻，其余各组裸鼠的精神状态，活动进食饮水情况相对稳定，未出现明显变化。
   
　　2.5  不良反应
   
　　在整个治疗试验过程中，没有出现荷瘤裸鼠死亡。B、C组部分裸鼠在治疗过程中偶尔出现散在红斑、丘疹，给予苯海拉明治疗2～3 d后上述症状即可消失。
   
　　2.6  各组荷瘤裸鼠的瘤体体积变化及比较
   
　　20只裸鼠在接种骨肉瘤细胞后4～5 d均出现臀部皮下肿瘤，并迅速膨大，14 d后肿瘤体积为（138.53±32.29）mm3，进行随机分组后，各组间瘤体体积差异无显著性（P＞0.05）。A组裸鼠肿瘤经顺铂治疗后出现生长抑制，肿瘤终体积为（103.50±23.06）mm3，以D组作为对照，计算I.I为78.53％;B组裸鼠肿瘤经多西紫杉醇治疗后出现明显生长抑制，肿瘤体积减小，终体积为（76.35±6.44）mm3，计算I.I为84.16％；C组裸鼠肿瘤经联合治疗后生长抑制更明显，瘤体体积缩小更为显著，且至21 d后仍未出现肿瘤再增长趋势，肿瘤终体积为（15.54±2.08）mm3，计算I.I为96.78％；D组裸鼠肿瘤呈恶性持续增长，注射生理盐水21 d后肿瘤体积达（482.03±85.95）mm3，肿瘤表面血管扩张，部分形成火山状溃疡（表3）。

　　表3  多西紫杉醇（DTX）和顺铂（CDDP）对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用（略）

　　*P＜0.01,vs Control group;#P＜0.05,vs DTX+CDDP group。   

　　各组肿瘤体积值组间两两比较显示：A、B、C 3组分别与D组比较差异有显著性（P＜0.01），A、B 2组分别与C组比较差异亦有显著性（P＜0.05），A组与B组间的差异无显著性（P＞0.05）。

　　2.7  血涂片、骨髓涂片结果
   
　　各组裸鼠血常规和骨髓涂片检测的结果显示，与D组比较，其余各组各种细胞数及各细胞系分类均无明显差异（P＞0.05），组间两两比较显示各组间的差异亦无显著性（P＞0.05）。
   
　　2.8  HE染色结果
   
　　各组裸鼠肺部均未见明显的肿瘤转移灶，且肝、脾、肺、肾均未见明显异常。肿瘤HE染色显示：D组肿瘤细胞密集，核仁粗大，可见较多核分裂相（图4）。A组肿瘤细胞密度较D组低，但较B、C组明显密集。B组肿瘤切面可见明显坏死灶，局部纤维组织增生，镜下见肿瘤细胞较A、D组明显稀疏，但核质深染，核仁粗大。C组肿瘤细胞最稀疏，大部分为纤维组织代替（图5）。
   
　　3  讨论
   
　　多西紫杉醇是一种从红豆杉的针叶中提取的非细胞毒性的前驱体，经化学修饰而得到的紫杉醇类抗肿瘤药，其作用主要是通过促进微管聚合形成稳的微管聚合物，并抑制其解聚，从而使游离的微管数量显著减少，抑制纺锤体向两极分离，阻滞细胞G2和M期，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖〔3〕。
   
　　顺铂是骨肉瘤化疗的经典药物之一，其抗癌作用强、抗癌活性高，毒性谱与其他抗癌药物有不同之处，与多种抗肿瘤药物有协同作用，且无交叉耐药性。国内外相关文献报道均认为骨肉瘤化疗方案中以含有顺铂的联合化疗方案较为理想〔4〕。但由于其严重毒副作用和日渐突出的耐药性问题，使其临床应用受限制，疗效也受到影响。选择能有效与之配伍的药物，进而提高顺铂疗效，是提高骨肉瘤治愈率的有效措施。
   
　　多西紫杉醇和顺铂两者单用化疗都是有效的，而且有着不同的作用机制，因此这种联用可能会产生累加效应。这种联合化疗已广泛用于多种肿瘤的治疗，且表现出这种联用在不同肿瘤化疗中的可行性和效果〔5～8〕。但这种联合用药在骨肉瘤的治疗中还未见报道，考虑到这两种药单用时的效应，不同的作用机制，不同的毒性，作者设计了这个试验，通过体内和体外实验观察这种联合用药的疗效和不良反应。
   
　　作者通过形态学观察，流式细胞术对药物处理的骨肉瘤细胞进行了检测，都呈现典型的凋亡特征。在形态学上，表现出不同程度的细胞皱缩，边缘毛糙，部分细胞核染色质固缩，聚集于核边，胞浆浓缩，出现由核碎裂形成的凋亡小体。流式细胞术分析结果显示，在DNA组方图显示峰值不同的小于2C DNA的亚G1峰（凋亡细胞峰），由此可见多西紫杉醇、顺铂均可诱导骨肉瘤细胞株HOS-8603凋亡（P＜0.05），多西紫杉醇和顺铂合用，则诱导细胞凋亡的作用明显增强（P＜0.05）。研究表明，化疗药物主要通过诱导癌细胞的凋亡达到治疗目的，癌细胞对化疗药物的敏感性决定了抗癌的有效性，化疗药物诱导癌细胞凋亡的能力被视为评估疗效的一项指标〔9、10〕。多西紫杉醇和顺铂联合化疗作用可能是通过增强诱导骨肉瘤细胞凋亡而实现的。
   
　　MIT实验证明细胞存活率与药物浓度呈反比，且有明显的剂量依赖性，随着时间的延长，药物的敏感性增加，同一剂量的药物有时间依赖关系，并且联合用药对细胞的抑制率明显大于单独用药的抑制率。
   
　　在体外实验的基础上，作者观察了多西紫杉醇和顺铂在体内试验中，对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用，两者联合应用有显著的协同抗肿瘤效应，该作用可能是通过增强对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡来实现的，具体的机制尚需其他实验研究探讨。两者合用后，肝、肾、脾及肺均未见病变，血涂片和骨髓涂片均未见异常，提示二者合用在增加疗效的同时毒副作用并未增加，该结果对于骨肉瘤的临床治疗有借鉴意义。
   
　　综上所述，本实验证明多西紫杉醇与顺铂协同作用可以显著增强它们对骨肉瘤细胞HOS-8603的增殖抑制，促进其凋亡，使荷瘤鼠肿瘤体积显著下降，而毒副作用并未增加，证明其二者联合用药可加强对骨肉瘤的治疗效果，为临床应用提供了实验依据，为今后骨肉瘤治疗提供了一种新的化疗方案。

　　（本文附图见加页1）
   

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作者单位：武汉大学中南医院骨科，武汉 430071