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【关键词】 骨发生相关因子基因转导在骨组织工程中
自1965年Urist报道用脱钙骨基质植入肌肉诱导基质细胞分化形成新骨以来，骨组织工程得到迅速发展，组织工程组织的构建设计也日趋成熟，支架材料与种子细胞加生长因子被认为是组织工程中的3大经典要素组合，是骨组织工程的研究热点之一。但生长因子单纯同支架材料与种子细胞复合修复组织缺损存在易受血液稀释、酶解，释放时间及浓度不易控制等缺陷。而通过基因转染产生的的小剂量内源性生长因子修复组织缺损远比更大剂量的外源性生长因子有效，近年来国内外已开始应用细胞及分子生物学技术将生长因子相关基因通过基因转移技术导入种子细胞，使目的基因能在种子细胞有效表达，诱导其定向组织分化，即基因修饰的组织工程。本文仅对近年骨组织工程中骨发生相关因子基因的研究进展作一综述。
1 骨相关生长因子（bone related growth factors）
1.1 骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）
BMP属于TGFβ超家族成员，至今已经发现了40余种。其中以BMP2和BMP7的研究最为透彻，大量的研究报告认为二者具有可靠的诱导成骨分化的作用，美国FDA已经批准其用于临床实验。在生长因子基因修饰骨组织工程方面，二者也是研究的热点，近2年来国内外已经有相当数量的实验证明应用载体介导的BMP2和BMP7基因能够在种子细胞成功表达并能显著促进组织修复〔1～4〕。除此之外，其他的BMP因子也具有相似的作用。John A.Jane等〔5〕将携带BMP4的腺病毒载体直接注入小牛肌肉组织内，第3 d时可以在肌肉组织中观察到原始间叶细胞，第9 d这些细胞部分开始分化为成熟的软骨细胞并形成软骨骨岛，第21 d时异位成骨组织的一半为软骨组织，第60 d时不成熟骨组织基本分化为成骨细胞和骨细胞，但仍可观察到“软骨巢”，90 d后在肌肉组织中可以看见塑形良好的成熟骨组织。用AdBMP6进行对比实验，与AdBMP4诱导成骨不同的是，第9 d并未见软骨细胞形成，而是间叶细胞的大量增殖，第21 d骨组织结构支架轮廓形成并开始钙化，在第60 d时已分化为塑形良好的成熟骨组织。A.L.Bertone等〔6〕经皮注射腺病毒载体介导的BMP6（AdhBMP6）联合绿色荧光蛋白标记载体（AdGFP）治疗新西兰白兔尺骨缺损，并在不同时期对成骨情况进行免疫组化、生物力学分析，认为与相同动物模型下BMP2基因转染诱导成骨相比，BMP6具有同BMP2相似的成骨效果。
1.2 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）
骨组织工程领域的研究在几十年来有很大发展，然而到目前为止，如何应用组织工程骨修复大块骨缺损仍是一个难题，其主要原因之一就是组织工程的血管化问题难以解决。VEGF由于具有显著的促血管生成作用，在组织工程骨血管化研究的过程中，扮演了一个不可或缺的角色。JaeHyungJang〔7〕将聚丙交脂乙二醇微粒Poly（D，LLactidecoGlycolide）和构建好的用荧光素酶标志的含有VEGF165和CMV启动子（cytomegalovirus promoter）的质粒在乳糖液中混合后加冻干，模具灌注塑形加压，对其表面进行湿化和糙化处理后制成多孔渗水支架PLG支架，将其植入雄性CD1鼠皮下，静脉注射D荧光素，应用IVIS成像系统，可以观察到植入部位荧光素含量在实验中随着大鼠体重的增加而成比例增加，3周后对植入支架周围3个不同方向组织进行切片进行血管记数，其结果为实验组血管数＞100／mm2，无VEGF165的对照组血管数＞60／mm2，从实验组和对照组切取的9张组织切片中分别随机抽取的420条微血管口径面积运用NIH Image software进行测定，发现实验组血管平均口径面积为532.2 μm2，对照组血管平均口径面积为225.2 μm2。Jonghoe Byun〔8〕构建了兔后肢缺血动物模型，将AAVmVEGFl20（介导mVEGFl20基因的腺相关病毒载体）分别注射到内收、四头肌和半膜肌中，8周后与注射PBS的对照组进行对照并进行统计学分析，发现实验组肌肉VEGF的含量及毛细血管与肌纤维比（Capillary to musclefiber ratio）都显著高于对照组。
1.3 胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor1，IGF1）
IGF是一类多功能细胞增殖调控因子，因其化学结构与胰岛素原类似而得名。在体外IGFl可以刺激关节软骨蛋白聚糖的合成和细胞的分裂增殖。在体内，外源性IGF1也能明显促进软骨愈合。LeeChuan C，Yeh等〔9〕构建了包括成骨蛋白1（osteogenic protein1，OPl，BMP7）基因编码序列的质粒pW24、包含IGF1基因序列的质粒pI和仅包含CMV启动子的空白质粒，pW24和pI共同转染幼鼠颅骨（FRC）细胞，在转染后24、48 h及以后测定细胞相对碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）活性，与pW24单独转染组和空白组相比，发现共同转染组AP活性显著高于对照组，而且AP活性同转染pI的量成正相关。Nixon〔10〕将IGF1基因转染至马软骨细胞、软骨祖细胞和滑膜细胞，发现这些细胞在单层培养的情况下可以持续分泌治疗剂量的IGFI达28 d之久，其中软骨细胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原远高于其他细胞，但Madry等人〔11〕将IGFl转染关节软骨细胞后却未发现有Ⅱ型胶原表达分泌，造成实验结果差异的因素之一可能是由于2个实验中基因载体不同造成，Nixon等使用的是腺病毒载体进行体外实验，转染效率为40%～50％，而Madry等使用FuGene 6载体（非病毒载体）进行体内实验，转染效率为35％。P.Smith等〔12〕用AdIGFl体外转染兔关节软骨细胞，然后将其植入到关节软骨缺损处，8周后可以看到植入部位形成形态结构良好的透明软骨，在兔动物实验模型进行相同的实验却获得了类似的结果，由此可见在不同种类细胞IGF的表达有其多样性。
1.4 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）
1974年，Gospodarowicz D等首次从牛神经组织纯化到成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF），它被认为是血管生成刺激因子、成纤维细胞增殖趋化因子、成肌细胞、角膜细胞、神经细胞生长等的刺激因子，在促进新生血管形成，促进骨、神经组织等组织损伤的修复中起着重要的作用。XiaoTian Wang〔13〕用AAV2bFGF和辅助质粒共同转染人293细胞以获得高滴度的AAV2bFGF，再将其转染鼠腱细胞，同法转染AAV2LacZ和空载体（此二组为对照组）至鼠腱细胞，培养10 d后检测发现实验组bFGF、collagenⅠ、collagenⅢ基因表达显著高于对照组，而这些基因表达水平的上调更有利于相关因子合成分泌增加，加快组织修复进程。Magali Cucchiarini等〔14〕用钻孔法造成野兔双膝关节关节面软骨缺损，采用左右膝关节面自身对照，用重组腺相关病毒（recombinant adenoassociated virus，rAAV）作为载体，构建rAAVlacZ和rAAVhFGF2，转染兔软骨细胞后用藻酸盐包裹转染细胞植入软骨缺损处，40 d后进行组织切片观察，并对实验结果通过相应指标量化分级评分，从缺损组织修复（filling of defect）、整合（integration）等8个方面进行数据分析后进行统计分析，认为实验组（rAAVhFGF2）在组织修复、修复细胞形态、修复组织结构3个方面具有显著差异，其他5个方面2组无明显差异。2组综合对比实验组组织修复效果优于对照组。
1.5 血小板衍化生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）
PDGF是一种可促进多种细胞增殖的生长因子，在骨组织中含量丰富，由位于22号和7号染色体上2个独立的基因PDGFA和PDGFB编码，两基因编码的多肽链有56％的同源序列，通过二硫键形成3种二聚物AA、BB、AB。在体外PDGF是一种有效的促骨发生因子，在骨发生吸收和间接诱导血管、软骨、基质发生方面都具有积极的作用，Danling Gu等〔15〕制作了一种适合细胞生长和基因表达的生物相容性基质支架GAM（geneactivated matrix）将AdPDGFB载入GAM后填充到兔全层皮肤缺损伤口中，分别于不同时间段对填充修复组织进行切片，用原位杂交和免疫组化等方法检测PDGF表达和修复组织结构，同AdLuc／GAM和单纯GAM填充的对比组实验结果进行统计分析，发现其修复能力高于对比组，在能有效修复组织低剂量AdPDGFB时，PCR法在伤口周围未能检测到病毒载体，在高剂量时，病毒载体只分布在附近的淋巴结中，而血液及各大器官中检测结果为阴性，认为AdPDGFB局部应用具有较高的安全性。Qiming Jin〔16〕的研究从体外和体内实验证实腺病毒介导的PDGFB基因转染细胞后可以获得高效表达，并具有良好诱导成骨诱导作用。研究人员用腺病毒（Adenovirus，Ad）作载体，将足量AdPDGFB，Adluciferase，AdPDGF1308（为PDGFA基因突变而来）体外转染至鼠真皮纤维原细胞（dermal fibroblasts，DFs）中，转染后48 h用Northern blotting法可以检测到AdPDGFB组有高浓度的PDGFB基因表达，而在Adluciferase、AdPDGF1308和NT（no treatment）组均未见到有相关基因表达。构建小鼠第1、2磨牙牙槽骨缺损模型，将AdPDGFB，Adluciferase，AdPDGF1308同胶原质制成混合溶剂后分别注射至牙槽骨缺损部位，应用PCNA（proliferating cell nuclear antigen）免疫组化方法检测可见第3 d在AdPDGFB组的外围阳性着色细胞已经多于胶原组和AdPDGF1308组，而在第7 d时则显著高于2组。除此之外，组织切片可以看到同其他组及单独应用胶原组相比在AdPDGFB组可以看见非常显著的牙周组织新生血管形成。
2 骨相关转录因子（bone related transcription factors）
转录因子是将DNA绑定在特定启动子位点起转录调控的一类蛋白，与生长因子相比，转录因子不需外分泌即可以发生其效应，并可以诱导其他多种生长因子同时表达，在目前基因修饰的骨组织工程主要有以下2种：
2.1 LIM矿化蛋白（LIM mineralization protein1，LMP）
LIM蛋白在一系列不同的生物学过程中具有重要功能，其结构域最早发现于Lin11，Is11和Mec3这3种同形域蛋白质中，故以它们的首字母将该蛋白命名为“LIM”。LIM结构域由2个串联的锌指结构组成，富含半胱氨酸和组氨酸，具有明显的上调BMPS表达和诱导异位成骨作用。〔17〕LMP包括LMP1、LMP2、LMP3，其中LMP1在1998年被首次定义，在基因转导体外实验和脊柱重建实验模型中证明其具有诱导成骨和促进脊柱融合的作用，Akihito Minamide〔18〕将LMPlcDNA和B牛乳糖（Bgalactosidase，AdBgal）cDNA重组入腺病毒后转染A549细胞，与BMP2、4、6、7进行混合体外培养，2 d后通过免疫组化方法检测发现AdLMP1组胞内BMP2、4、7染色强阳性。将AdLMP1和AdBgal分别转染入人外周血白细胞后用胶原质包裹，将其分别植入去胸腺小鼠的胸部，在第10 d时可以在AdLMP1组胶原纤维间看见成骨样细胞，14 d从植入物边缘向内持续可见骨样和矿化蛋白存在，未见到软骨发生阶段，在第3和第5 d AdLMP1组植入物细胞中可以检测到BMP4、7强阳性染色，而AdBgal和空的对照组阴性。以E Pola〔19〕领导的实验小组在体外将含人LMP3和BMP2基因的质粒分别转染至鼠类MC3T3E1和NIH3T3细胞中，48 h后运用半定量RTPCT技术检测显示2组细胞中3种骨基因标志物OC（bonespecific genes osteocalcin）、OP（osteopontin）和BSP（bone sialoprotein）表达水平相近，将LMP3和BMP2基因用腺病毒介导进行相同细胞转染也取得了类似的结果，证实LMP3作为一种细胞内骨诱导因子在体外诱导成骨效率与BMP2无明显的差异，研究人员将AdLMP3和AdBMP2注射到C57BL／6J大鼠后肢肌肉中，3周后可以发现AdLMP3组注射部位异位成骨明显，5周后从成骨密度、范围、组织学和影像学方面分析发现AdLMP3组成骨效果远优于AdLMP2，在小鼠骨折模型实验中也发现了AdLMP3组修复骨折的速度要高于AdBMP2组。
2.2 Runx 2／Cbfa 1
Runx家族蛋白由Runx 1、Runx 2和Runx 3组成，都有一个DNA结合结构域Runt，它们都有1个由128个氨基酸组成的DNA结合域，该结构域与果蝇的成对控制（pair rule）基因Runt序列同源，故称为Runt域。近年来对Runt相关基因（Runx）家族的研究取得了明显进展，Runx蛋白在多种细胞谱系中发挥重要作用，Runx 1参与造血干细胞分化，Runx 3在胃上皮细胞调控中发挥重要作用。而Runx 2在成骨细胞（osteoblast，OB）分化、软骨细胞成熟及骨基质蛋白的产生等中发挥重要作用，又称核心结合因子α1（corebinding factor α1，CBFA 1）或多瘤病毒增强子结合蛋白（polyoma enhancerbinding protein 2αA，PEBP2α A）及急性骨髓性白血病因子3（acute myeloid leukemia 3，AML 3），属于Runx结构域基因家族的转录因子。Runx 2是成骨细胞分化的重要调控基因，决定多能间充质细胞向成骨细胞系分化，Inada〔20〕利用原位杂交方法对Runx 2在软骨细胞中的表达加以研究，发现其表达与软骨细胞的分化程度呈正相关，在Runx 2基因敲除小鼠，其软骨细胞的分化严重受阻，只能在四肢长骨中观测到X型胶原表达，提示Runx 2蛋白在软骨的形成分化中有重要的作用。Benjamin A〔21〕从雄性Wistar鼠骨髓中分离培养骨髓基质干细胞（MSC），将Runx 2用逆转录病毒介导至MSC中，可以观察碱性磷酸酶活性和矿化能力得到增强，骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）高水平表达，而OCN是ECMP中含量最丰富的一种，也是迄今被证明的唯一仅由OB产生的骨细胞外基质蛋白（extracellular matrix protein，ECMP），被认为是OB分化和成熟的标志。
3 多因子共同表达
人和哺乳动物细胞、组织在发生时受体内环境多种因素的影响，其中就包括多种多样的生长因子协同或制约调制分化发育，同体内复杂的内环境相比，体外单一的生长因子基因转染促进组织生长显得相对不足，理论上来说体外多因子协同作用应该比单个因子更完善，已有的研究也表明多因子作用修复组织缺损具有协同作用，其效果优于单因子。S.Yang〔22〕用Runx 2和BMP2联合作用刺激成骨细胞分化，发现不论在体内还是体外，其成骨细胞分化远较应用单因子显著。Yukio Nakamura等〔23〕在BMP2小鼠体内异位成骨实验中用低剂量FGF2通过信号旁路作用于种子细胞，发现BMPR（BMP受体）数量明显上调，使BMP2诱导成骨能力增强。但目前较多的研究只是将2种或2种以上的生长因子单纯加入支架材料和种子细胞中，观察对成骨的影响，如前所述，这种方法有生长因子容易酶解、稀释和浓度及作用时间不恒定等缺陷。国外学者开始将不同生长因子基因转染细胞后进行联合培养，希望通过稳定的目的基因表达而获得较恒定持久的因子浓度。多个因子协同作用大致可以通过2个方法来实现，一是不同因子各自转染种子细胞后，再将细胞联合培养；LeeChuan C等〔9〕在2个独立实验中将OP1和VEGF、OP1和IGF1分别转染种子细胞后联合培养诱导分化成骨，认为其成骨效果优于单因子。二是直接将不同生长因子基因整合后共同转染种子细胞；后者对基因载体的要求较高，而且多基因共同转染可能会影响不同目的基因表达效率。尽管在动物或人体内环境中存在多种多样的生长因子，但在国外已有的研究中罕见2个以上的生长因子相关基因协同作用方面的报告，除考虑基因对表达效率的影响外，很大的一个原因可能是多因子间相互作用的量效关系目前尚不明确，随着因子数量的增加，实验设计和技术要求也随之大大增加。
4 展望
基因工程和细胞分子生物科学的发展无疑为骨组织工程的发展提供了新的契机，将基因工程和细胞分子生物科学等前沿学科与组织工程结合是未来骨组织工程发展的必然趋势，毋容置疑，骨相关生长因子基因在基因化骨组织工程中扮演着一个非常重要的角色，骨相关生长因子基因转导在近年的研究中也已经取得了一些令人鼓舞的进展，其发展也朝着多因子多元化方向发展，但同时也对组织工程支架材料和转导载体提出了更高的要求，后者相关研究的滞后在某种很大程度会制约基因骨组织工程的发展，也许尚需长时间的探索研究，但材料科学、细胞分子生物科学和越来越多边缘学科的发展将为基因组织工程的研究拓宽道路，基因骨组织工程将改变人们对组织工程学的传统观念，开创一个崭新的组织修复重建医学时代。
【参考文献】
自1965年Urist报道用脱钙骨基质植入肌肉诱导基质细胞分化形成新骨以来，骨组织工程得到迅速发展，组织工程组织的构建设计也日趋成熟，支架材料与种子细胞加生长因子被认为是组织工程中的3大经典要素组合，是骨组织工程的研究热点之一。但生长因子单纯同支架材料与种子细胞复合修复组织缺损存在易受血液稀释、酶解，释放时间及浓度不易控制等缺陷。而通过基因转染产生的的小剂量内源性生长因子修复组织缺损远比更大剂量的外源性生长因子有效，近年来国内外已开始应用细胞及分子生物学技术将生长因子相关基因通过基因转移技术导入种子细胞，使目的基因能在种子细胞有效表达，诱导其定向组织分化，即基因修饰的组织工程。本文仅对近年骨组织工程中骨发生相关因子基因的研究进展作一综述。
1 骨相关生长因子（bone related growth factors）
1.1 骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）
BMP属于TGFβ超家族成员，至今已经发现了40余种。其中以BMP2和BMP7的研究最为透彻，大量的研究报告认为二者具有可靠的诱导成骨分化的作用，美国FDA已经批准其用于临床实验。在生长因子基因修饰骨组织工程方面，二者也是研究的热点，近2年来国内外已经有相当数量的实验证明应用载体介导的BMP2和BMP7基因能够在种子细胞成功表达并能显著促进组织修复〔1～4〕。除此之外，其他的BMP因子也具有相似的作用。John A.Jane等〔5〕将携带BMP4的腺病毒载体直接注入小牛肌肉组织内，第3 d时可以在肌肉组织中观察到原始间叶细胞，第9 d这些细胞部分开始分化为成熟的软骨细胞并形成软骨骨岛，第21 d时异位成骨组织的一半为软骨组织，第60 d时不成熟骨组织基本分化为成骨细胞和骨细胞，但仍可观察到“软骨巢”，90 d后在肌肉组织中可以看见塑形良好的成熟骨组织。用AdBMP6进行对比实验，与AdBMP4诱导成骨不同的是，第9 d并未见软骨细胞形成，而是间叶细胞的大量增殖，第21 d骨组织结构支架轮廓形成并开始钙化，在第60 d时已分化为塑形良好的成熟骨组织。A.L.Bertone等〔6〕经皮注射腺病毒载体介导的BMP6（AdhBMP6）联合绿色荧光蛋白标记载体（AdGFP）治疗新西兰白兔尺骨缺损，并在不同时期对成骨情况进行免疫组化、生物力学分析，认为与相同动物模型下BMP2基因转染诱导成骨相比，BMP6具有同BMP2相似的成骨效果。
1.2 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）
骨组织工程领域的研究在几十年来有很大发展，然而到目前为止，如何应用组织工程骨修复大块骨缺损仍是一个难题，其主要原因之一就是组织工程的血管化问题难以解决。VEGF由于具有显著的促血管生成作用，在组织工程骨血管化研究的过程中，扮演了一个不可或缺的角色。JaeHyungJang〔7〕将聚丙交脂乙二醇微粒Poly（D，LLactidecoGlycolide）和构建好的用荧光素酶标志的含有VEGF165和CMV启动子（cytomegalovirus promoter）的质粒在乳糖液中混合后加冻干，模具灌注塑形加压，对其表面进行湿化和糙化处理后制成多孔渗水支架PLG支架，将其植入雄性CD1鼠皮下，静脉注射D荧光素，应用IVIS成像系统，可以观察到植入部位荧光素含量在实验中随着大鼠体重的增加而成比例增加，3周后对植入支架周围3个不同方向组织进行切片进行血管记数，其结果为实验组血管数＞100／mm2，无VEGF165的对照组血管数＞60／mm2，从实验组和对照组切取的9张组织切片中分别随机抽取的420条微血管口径面积运用NIH Image software进行测定，发现实验组血管平均口径面积为532.2 μm2，对照组血管平均口径面积为225.2 μm2。Jonghoe Byun〔8〕构建了兔后肢缺血动物模型，将AAVmVEGFl20（介导mVEGFl20基因的腺相关病毒载体）分别注射到内收、四头肌和半膜肌中，8周后与注射PBS的对照组进行对照并进行统计学分析，发现实验组肌肉VEGF的含量及毛细血管与肌纤维比（Capillary to musclefiber ratio）都显著高于对照组。
1.3 胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor1，IGF1）
IGF是一类多功能细胞增殖调控因子，因其化学结构与胰岛素原类似而得名。在体外IGFl可以刺激关节软骨蛋白聚糖的合成和细胞的分裂增殖。在体内，外源性IGF1也能明显促进软骨愈合。LeeChuan C，Yeh等〔9〕构建了包括成骨蛋白1（osteogenic protein1，OPl，BMP7）基因编码序列的质粒pW24、包含IGF1基因序列的质粒pI和仅包含CMV启动子的空白质粒，pW24和pI共同转染幼鼠颅骨（FRC）细胞，在转染后24、48 h及以后测定细胞相对碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）活性，与pW24单独转染组和空白组相比，发现共同转染组AP活性显著高于对照组，而且AP活性同转染pI的量成正相关。Nixon〔10〕将IGF1基因转染至马软骨细胞、软骨祖细胞和滑膜细胞，发现这些细胞在单层培养的情况下可以持续分泌治疗剂量的IGFI达28 d之久，其中软骨细胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原远高于其他细胞，但Madry等人〔11〕将IGFl转染关节软骨细胞后却未发现有Ⅱ型胶原表达分泌，造成实验结果差异的因素之一可能是由于2个实验中基因载体不同造成，Nixon等使用的是腺病毒载体进行体外实验，转染效率为40%～50％，而Madry等使用FuGene 6载体（非病毒载体）进行体内实验，转染效率为35％。P.Smith等〔12〕用AdIGFl体外转染兔关节软骨细胞，然后将其植入到关节软骨缺损处，8周后可以看到植入部位形成形态结构良好的透明软骨，在兔动物实验模型进行相同的实验却获得了类似的结果，由此可见在不同种类细胞IGF的表达有其多样性。
1.4 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）
1974年，Gospodarowicz D等首次从牛神经组织纯化到成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF），它被认为是血管生成刺激因子、成纤维细胞增殖趋化因子、成肌细胞、角膜细胞、神经细胞生长等的刺激因子，在促进新生血管形成，促进骨、神经组织等组织损伤的修复中起着重要的作用。XiaoTian Wang〔13〕用AAV2bFGF和辅助质粒共同转染人293细胞以获得高滴度的AAV2bFGF，再将其转染鼠腱细胞，同法转染AAV2LacZ和空载体（此二组为对照组）至鼠腱细胞，培养10 d后检测发现实验组bFGF、collagenⅠ、collagenⅢ基因表达显著高于对照组，而这些基因表达水平的上调更有利于相关因子合成分泌增加，加快组织修复进程。Magali Cucchiarini等〔14〕用钻孔法造成野兔双膝关节关节面软骨缺损，采用左右膝关节面自身对照，用重组腺相关病毒（recombinant adenoassociated virus，rAAV）作为载体，构建rAAVlacZ和rAAVhFGF2，转染兔软骨细胞后用藻酸盐包裹转染细胞植入软骨缺损处，40 d后进行组织切片观察，并对实验结果通过相应指标量化分级评分，从缺损组织修复（filling of defect）、整合（integration）等8个方面进行数据分析后进行统计分析，认为实验组（rAAVhFGF2）在组织修复、修复细胞形态、修复组织结构3个方面具有显著差异，其他5个方面2组无明显差异。2组综合对比实验组组织修复效果优于对照组。
1.5 血小板衍化生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）
PDGF是一种可促进多种细胞增殖的生长因子，在骨组织中含量丰富，由位于22号和7号染色体上2个独立的基因PDGFA和PDGFB编码，两基因编码的多肽链有56％的同源序列，通过二硫键形成3种二聚物AA、BB、AB。在体外PDGF是一种有效的促骨发生因子，在骨发生吸收和间接诱导血管、软骨、基质发生方面都具有积极的作用，Danling Gu等〔15〕制作了一种适合细胞生长和基因表达的生物相容性基质支架GAM（geneactivated matrix）将AdPDGFB载入GAM后填充到兔全层皮肤缺损伤口中，分别于不同时间段对填充修复组织进行切片，用原位杂交和免疫组化等方法检测PDGF表达和修复组织结构，同AdLuc／GAM和单纯GAM填充的对比组实验结果进行统计分析，发现其修复能力高于对比组，在能有效修复组织低剂量AdPDGFB时，PCR法在伤口周围未能检测到病毒载体，在高剂量时，病毒载体只分布在附近的淋巴结中，而血液及各大器官中检测结果为阴性，认为AdPDGFB局部应用具有较高的安全性。Qiming Jin〔16〕的研究从体外和体内实验证实腺病毒介导的PDGFB基因转染细胞后可以获得高效表达，并具有良好诱导成骨诱导作用。研究人员用腺病毒（Adenovirus，Ad）作载体，将足量AdPDGFB，Adluciferase，AdPDGF1308（为PDGFA基因突变而来）体外转染至鼠真皮纤维原细胞（dermal fibroblasts，DFs）中，转染后48 h用Northern blotting法可以检测到AdPDGFB组有高浓度的PDGFB基因表达，而在Adluciferase、AdPDGF1308和NT（no treatment）组均未见到有相关基因表达。构建小鼠第1、2磨牙牙槽骨缺损模型，将AdPDGFB，Adluciferase，AdPDGF1308同胶原质制成混合溶剂后分别注射至牙槽骨缺损部位，应用PCNA（proliferating cell nuclear antigen）免疫组化方法检测可见第3 d在AdPDGFB组的外围阳性着色细胞已经多于胶原组和AdPDGF1308组，而在第7 d时则显著高于2组。除此之外，组织切片可以看到同其他组及单独应用胶原组相比在AdPDGFB组可以看见非常显著的牙周组织新生血管形成。
2 骨相关转录因子（bone related transcription factors）
转录因子是将DNA绑定在特定启动子位点起转录调控的一类蛋白，与生长因子相比，转录因子不需外分泌即可以发生其效应，并可以诱导其他多种生长因子同时表达，在目前基因修饰的骨组织工程主要有以下2种：
2.1 LIM矿化蛋白（LIM mineralization protein1，LMP）
LIM蛋白在一系列不同的生物学过程中具有重要功能，其结构域最早发现于Lin11，Is11和Mec3这3种同形域蛋白质中，故以它们的首字母将该蛋白命名为“LIM”。LIM结构域由2个串联的锌指结构组成，富含半胱氨酸和组氨酸，具有明显的上调BMPS表达和诱导异位成骨作用。〔17〕LMP包括LMP1、LMP2、LMP3，其中LMP1在1998年被首次定义，在基因转导体外实验和脊柱重建实验模型中证明其具有诱导成骨和促进脊柱融合的作用，Akihito Minamide〔18〕将LMPlcDNA和B牛乳糖（Bgalactosidase，AdBgal）cDNA重组入腺病毒后转染A549细胞，与BMP2、4、6、7进行混合体外培养，2 d后通过免疫组化方法检测发现AdLMP1组胞内BMP2、4、7染色强阳性。将AdLMP1和AdBgal分别转染入人外周血白细胞后用胶原质包裹，将其分别植入去胸腺小鼠的胸部，在第10 d时可以在AdLMP1组胶原纤维间看见成骨样细胞，14 d从植入物边缘向内持续可见骨样和矿化蛋白存在，未见到软骨发生阶段，在第3和第5 d AdLMP1组植入物细胞中可以检测到BMP4、7强阳性染色，而AdBgal和空的对照组阴性。以E Pola〔19〕领导的实验小组在体外将含人LMP3和BMP2基因的质粒分别转染至鼠类MC3T3E1和NIH3T3细胞中，48 h后运用半定量RTPCT技术检测显示2组细胞中3种骨基因标志物OC（bonespecific genes osteocalcin）、OP（osteopontin）和BSP（bone sialoprotein）表达水平相近，将LMP3和BMP2基因用腺病毒介导进行相同细胞转染也取得了类似的结果，证实LMP3作为一种细胞内骨诱导因子在体外诱导成骨效率与BMP2无明显的差异，研究人员将AdLMP3和AdBMP2注射到C57BL／6J大鼠后肢肌肉中，3周后可以发现AdLMP3组注射部位异位成骨明显，5周后从成骨密度、范围、组织学和影像学方面分析发现AdLMP3组成骨效果远优于AdLMP2，在小鼠骨折模型实验中也发现了AdLMP3组修复骨折的速度要高于AdBMP2组。
2.2 Runx 2／Cbfa 1
Runx家族蛋白由Runx 1、Runx 2和Runx 3组成，都有一个DNA结合结构域Runt，它们都有1个由128个氨基酸组成的DNA结合域，该结构域与果蝇的成对控制（pair rule）基因Runt序列同源，故称为Runt域。近年来对Runt相关基因（Runx）家族的研究取得了明显进展，Runx蛋白在多种细胞谱系中发挥重要作用，Runx 1参与造血干细胞分化，Runx 3在胃上皮细胞调控中发挥重要作用。而Runx 2在成骨细胞（osteoblast，OB）分化、软骨细胞成熟及骨基质蛋白的产生等中发挥重要作用，又称核心结合因子α1（corebinding factor α1，CBFA 1）或多瘤病毒增强子结合蛋白（polyoma enhancerbinding protein 2αA，PEBP2α A）及急性骨髓性白血病因子3（acute myeloid leukemia 3，AML 3），属于Runx结构域基因家族的转录因子。Runx 2是成骨细胞分化的重要调控基因，决定多能间充质细胞向成骨细胞系分化，Inada〔20〕利用原位杂交方法对Runx 2在软骨细胞中的表达加以研究，发现其表达与软骨细胞的分化程度呈正相关，在Runx 2基因敲除小鼠，其软骨细胞的分化严重受阻，只能在四肢长骨中观测到X型胶原表达，提示Runx 2蛋白在软骨的形成分化中有重要的作用。Benjamin A〔21〕从雄性Wistar鼠骨髓中分离培养骨髓基质干细胞（MSC），将Runx 2用逆转录病毒介导至MSC中，可以观察碱性磷酸酶活性和矿化能力得到增强，骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）高水平表达，而OCN是ECMP中含量最丰富的一种，也是迄今被证明的唯一仅由OB产生的骨细胞外基质蛋白（extracellular matrix protein，ECMP），被认为是OB分化和成熟的标志。
3 多因子共同表达
人和哺乳动物细胞、组织在发生时受体内环境多种因素的影响，其中就包括多种多样的生长因子协同或制约调制分化发育，同体内复杂的内环境相比，体外单一的生长因子基因转染促进组织生长显得相对不足，理论上来说体外多因子协同作用应该比单个因子更完善，已有的研究也表明多因子作用修复组织缺损具有协同作用，其效果优于单因子。S.Yang〔22〕用Runx 2和BMP2联合作用刺激成骨细胞分化，发现不论在体内还是体外，其成骨细胞分化远较应用单因子显著。Yukio Nakamura等〔23〕在BMP2小鼠体内异位成骨实验中用低剂量FGF2通过信号旁路作用于种子细胞，发现BMPR（BMP受体）数量明显上调，使BMP2诱导成骨能力增强。但目前较多的研究只是将2种或2种以上的生长因子单纯加入支架材料和种子细胞中，观察对成骨的影响，如前所述，这种方法有生长因子容易酶解、稀释和浓度及作用时间不恒定等缺陷。国外学者开始将不同生长因子基因转染细胞后进行联合培养，希望通过稳定的目的基因表达而获得较恒定持久的因子浓度。多个因子协同作用大致可以通过2个方法来实现，一是不同因子各自转染种子细胞后，再将细胞联合培养；LeeChuan C等〔9〕在2个独立实验中将OP1和VEGF、OP1和IGF1分别转染种子细胞后联合培养诱导分化成骨，认为其成骨效果优于单因子。二是直接将不同生长因子基因整合后共同转染种子细胞；后者对基因载体的要求较高，而且多基因共同转染可能会影响不同目的基因表达效率。尽管在动物或人体内环境中存在多种多样的生长因子，但在国外已有的研究中罕见2个以上的生长因子相关基因协同作用方面的报告，除考虑基因对表达效率的影响外，很大的一个原因可能是多因子间相互作用的量效关系目前尚不明确，随着因子数量的增加，实验设计和技术要求也随之大大增加。
4 展望
基因工程和细胞分子生物科学的发展无疑为骨组织工程的发展提供了新的契机，将基因工程和细胞分子生物科学等前沿学科与组织工程结合是未来骨组织工程发展的必然趋势，毋容置疑，骨相关生长因子基因在基因化骨组织工程中扮演着一个非常重要的角色，骨相关生长因子基因转导在近年的研究中也已经取得了一些令人鼓舞的进展，其发展也朝着多因子多元化方向发展，但同时也对组织工程支架材料和转导载体提出了更高的要求，后者相关研究的滞后在某种很大程度会制约基因骨组织工程的发展，也许尚需长时间的探索研究，但材料科学、细胞分子生物科学和越来越多边缘学科的发展将为基因组织工程的研究拓宽道路，基因骨组织工程将改变人们对组织工程学的传统观念，开创一个崭新的组织修复重建医学时代。
作者单位：第二军医大学附属长海医院骨关节外科，上海市杨浦区长海路174号 200433