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［摘要］ 目的 了解蛋白激酶与蛋白磷酸酯酶活性改变对阿尔茨海默病（AD）样神经原纤维变性的影响。方法 选择SD大鼠24只,随机分为实验组和对照组,各12只。实验组采用脑立体定位注射技术,向海马区注射20 mmol/L缓激肽（BK）和4.2 mmol/L环孢菌素A(CSA)各0.2 mL，对照组注射人工脑脊液0.4 mL，电跳台法测试大鼠学习与记忆状况；免疫印迹法检测Tau蛋白质磷酸化状况。结果 实验组鼠出现错误次数多于对照组（t=3.362,P<0.01），受电击时间长于对照组（t=4.537,P<0.01）。实验组海马区12E8显色强于对照组，Tau1显色弱于对照组。结论 BK和CSA可诱发Tau蛋白多个位点出现AD样异常磷酸化，导致动物学习记忆障碍。
［关键词］ 阿尔茨海默病; 钙神经素 ；蛋白激酶类 ；缓激肽；环孢菌素A；大鼠
IMBALANCE OF PROTEIN KINASE AND PROTEIN PHOSPHATASE INDUCES ALZHEIMERLIKE PHOSPHORYLATION OF TAU AND ABNORMAL BEHAVIOR IN RATSCHE FENGYUAN, CUI RUIYAO (Department of Pathophysiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effects of protein kinase and protein phosphatase imbalance on Alzheimerlike phosphorylation of Tau and abnormal behavior in rats. MethodsBK and CSA or CSF were injected into hippocampus, and their behaviors by electronic attackjump experiment and phosphorylation of Tau were observed by immunostaining assay. ResultsAn obvious disturbance in learning and memory was seen with BK and CSA injected rats. The results obtained by immunostaining assay indicated that the staining for 12E8 was stronger, and for Tau1 or PHF1 were weaker in BK and CSA injected rats compared with control group. The BK and CSA injected rats showed obvious deficits in behavior （t=3.362, P<0.01）. The rats were more struck by lightening than the controls （t=4.537, P<0.01）. ConclusionBK and CSA can induce both Alzheimerlike Tau phosphorylation and behavioral disturbance.
［KEY WORDS］Alzheimer disease；calcineurin；protein kinases；bradykinin；cyclosporine A; rats
阿尔茨海默病(AD)是严重危害中老年人身心健康的重大疾病,其病因及发病机制至今尚未完全阐明，建立理想的动物模型面临巨大的困难和挑战。AD最具特征性的神经病理改变是神经细胞内出现大量神经原纤维缠结（NFT）,这些NFT主要由双螺旋细丝（PHF）组成［1,2］。PHF主要由过度磷酸化的Tau蛋白构成［3,4］。Tau蛋白是神经系统特异性微管相关蛋白，在维持微管系统的稳定性中起重要作用［5,6］。异常修饰的Tau蛋白参与神经原纤维缠结的形成和稳定性的维持，从而在AD神经元退变中起重要作用［7］。脑内蛋白激酶、蛋白磷酸酯酶的失衡是导致Tau蛋白异常过度磷酸化的基础［8］。钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）和神经钙蛋白（PP2B）对Tau蛋白的异常磷酸化起重要作用。因此，如果能在整体水平激活CaMKⅡ活性和抑制PP2B活性，就有可能复制出骨架蛋白Tau的AD样异常磷酸化模型。本文采用脑立体定位注射技术,向海马注射缓激肽（BK）和环孢菌素A(CSA)作为实验组，注射人工脑脊液作为对照组，了解蛋白激酶、蛋白磷酸酯酶活性改变对AD样神经原纤维变性的影响。
1 材料和方法
1.1 抗体性质及来源单克隆抗体Tau1、12E8和PHF1由Binder和Greenberg提供。实验所用抗体识别的抗原和位点见表1。
1.2 动物及分组SD大鼠24只，4~6月龄,雄性,体质量（240±22）g，随机分为实验组和对照组,各12只。表1 实验所用抗体识别的抗原和位点
抗体识别的抗原和位点特性*稀释度Tau1Ser199/Ser202NP1∶25 000PHF1Ser396/Ser404P1∶ 50012E8Ser262/Ser356P2 mg/L *注：NP为非磷酸化；P为磷酸化
1.3 模型制备实验组将SD大鼠用50 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上，局部头顶去毛、消毒，正中矢状位切口，将骨膜分离、剥除。取前囟右侧2.5 mm，后5.3 mm处钻孔，自颅骨表面垂直进针于3.5 mm深处,用缓慢注射推进器于1 h内注射20 mmol/L BK和4.2 mmol/L CSA各0.2 mL,缝合包扎切口。对照组手术方法同实验组，注射0.4 mL人工脑脊液。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠学习及记忆能力测试 采用电跳台法。于手术后第5天开始，检测各组大鼠回避电击时所发生的错误次数及所受电击的时间,持续至术后第12天。
1.4.2 Tau蛋白磷酸化情况检测 于手术后第12天用断头法处死大鼠，迅速取出脑组织并置于4 ℃ 0.05 mol/L TBS溶液内，去除筋膜、血管、皮质后，大脑白质（含海马）内加入蛋白提取液匀浆，4 ℃，1 000 r/min离心10 min，取上清备用。采用免疫印迹显色法检测Tau蛋白磷酸化情况。
1.6 统计学分析数据用±s表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 两组大鼠学习及记忆能力测试实验组与对照组出现错误次数分别为9.85±0.27和6.28±1.10,受电击时间分别为(82.27±10.92)s和(46.97±12.03)s,差异均有显著性（t=3.362、4.537，P<0.01）。
2.2 Tau蛋白磷酸化检测实验组大鼠Tau1、PHF1显色均较对照组大鼠弱，而12E8显色较对照组鼠明显增强(图1)。定量分析显示,实验组与对照组Tau1 A值为27.21±3.06和35.24±4.21,PHF1 A值为17.68±2.83和25.37±2.96，12E8 A值为12.55±2.42和11.98±2.33,两组Tau1、PHF1比较,差异均有显著性（t=3.64、2.84,P<0.01）;两组12E8 A值比较,差异无显著性(t=1.685，P>0.05)。
3 讨 论
海马是突触强度的长时程增强(LTP)形成和学习记忆发生的重要区域,而且海马定位注射较易在局部形成较高的药物浓度而不至造成大脑的广泛损害。因此，本实验采用海马定位注射BK和CSA以研究CaMKⅡ和PP2B对Tau蛋白异常磷酸化的影响。CaMKⅡ是不同种属动物脑内广泛存在的一种非脯氨酸指导的蛋白激酶。所有大鼠脑源性CaMKⅡ亚基均含有ATP结合的序列、蛋白激酶催化活性中心及钙调素结合域。纯化的CaMKⅡ在钙或钙调素缺失时几乎无活性，而加入钙或钙调素后其活性最少增加200倍［9］。一旦与钙或钙调素结合，其分子构象即发生改变，每个催化结构域使邻近亚基的抑制结构域发生自身磷酸化，藉此激活CaMKⅡ，并依次磷酸化细胞中的其他靶蛋白，从而呈现其钙或钙调素依赖的生物学活性。CaMKⅡ可催化Tau蛋白Ser262/Ser356位点发生磷酸化，从而部分或完全抑制Tau蛋白促微管组装和维持微管稳定的活性。可见，CaMKⅡ在Tau蛋白磷酸化及其生物学功能调节中起重要作用。BK是一种直链的九肽，作为CaMKⅡ的特异性激活剂，可激活CaMKⅡ的活性。CaMKⅡ活化后，其Thr286位点发生自身磷酸化，CaMKⅡ即表现为非钙或钙调素依赖性活性形式，使AMPA型谷氨酸受体（AMPAR）磷酸化而反应性增强，后者是与学习记忆密切相关的LTP形成和维持的关键。CSA是由11个氨基酸组成的甲氨基壬烯醇酸，是目前器官移植术后常用的免疫抑制剂，也用于自身免疫性疾病的治疗。CSA透过胞膜进入胞液后与Cyclophilin结合为复合体,该复合体再与PP2B（存在于脑中的PP2B被称为Calcineurin，CN）结合,从而抑制PP2B的磷酸酯酶活性。CN是神经元内贮量最为丰富的一种磷酸酯酶（据报道占脑总蛋白质含量的1%），CN在体外可催化AD异常磷酸化的Tau蛋白多个位点去磷酸化，且在AD病人脑中其活性明显降低。生物细胞中蛋白质的磷酸化水平受蛋白激酶和磷酸酯酶的双重调节。AD病人蛋白质磷酸化系统的紊乱同时涉及蛋白激酶活性的上调和磷酸酯酶活性的下调。因此，在复制AD样磷酸化失衡模型时，同时激活蛋白激酶和抑制磷酸酯酶与AD病人的缺陷更为接近，因而更有望成功复制获得AD实验模型。基于这一研究思路，本研究将BK和CSA联合应用，以探讨激活CaMKⅡ和抑制PP2B时大鼠行为及Tau蛋白磷酸化的改变。结果表明，联合注射BK和CSA，实验组Tau1、PHF1显色较对照组弱，而12E8显色较对照组明显增强。海马注射BK和CSA后,大鼠电跳台法行为测试结果显示，大鼠出现学习记忆障碍。Tau抗体识别位点是Ser199/Ser202，PHF1识别位点是Ser396/Ser404，12E8抗体识别位点是Ser262/Ser356，因此提示，联合注射BK和CSA可使海马区域Tau蛋白Ser199/Ser202和Ser262/Ser356位点磷酸化作用增强，且此位点的磷酸化与大鼠行为改变有重要关系。此外，本研究中还观察到,联合注射B
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作者单位：中山大学附属二院骨科；中山大学附属二院放射科，广州510120