骨肉瘤诱导分化与多药耐药表型的生物学性状比较

【摘要】  ［目的］探讨诱导分化剂诱导骨肉瘤分化时同骨肉瘤耐药状态产生的分化情况的异同点，以便正确认识分化与耐药相关性。［方法］以诱导分化剂ATRA，IL4处理人成骨肉瘤细胞系，对比MG63耐药表型MG63/R，观察瘤细胞生物学性状。用原位杂交分析在这一转化过程上凋亡调控基因P53，bcl2 mRNA表达，用Tunel法分析细胞的凋亡。MTT法检查细胞对药物敏感性。［结果］MG63/R，以及IL4，ATRA处理的MG63，细胞均出现分化，ATRA处理的MG63表现多药耐药性，并同MG63/R表现出了相似的特性而IL4处理的细胞分化的同时并未出现耐药。［结论］肿瘤细胞分化的过程中有可能出现一种顽固的多药耐药的亚分化状态，这种差异性分化的产生可能同细胞种类、状态、药物作用特点及剂量有关，如何控制细胞向耐药状态的分化为肿瘤的治疗提出了新的难题。

【关键词】  骨肉瘤； 多药耐药； 分化； 凋亡； P53； bcl2; ATRA; IL4

　　传统观点认为骨肉瘤的耐药表型同骨肉瘤恶性程度成正相关，现在认为骨肉瘤耐药表型是一种相对分化的状态，其增殖能力、侵袭能力及转移能力较药敏肿瘤细胞呈明显下降。MDR/P170是经典的耐药途径，可使肿瘤细胞对多种结构和功能不相关的抗癌药产生耐药性。而且可以通过多种彼此结构功能无任何相关性的药物诱导产生翻译和表达〔3〕。据认为分化诱导剂在治疗恶性肿瘤使其化分的过程中能产生多药耐药性。在诱导肿瘤细胞产生多药耐药性的过程中同时也出现了分化。这两种分化状态的细胞是否存在着相关性？
   
　　本实验利用肿瘤细胞的诱导分化剂维甲酸和IL4分别诱导肿瘤细胞化〔8〕。比较观察维甲酸（ATRA）和IL4分别诱导的肿瘤细胞亚系同骨肉瘤的耐药表型之间在生物学上的异同点。
   
　　1  实验材料和方法
   
　　1.1  主要试剂和细胞
   
　　人成骨肉瘤细胞系MG63（武汉大学中国典型培养生物馆藏中心）及其耐药表型MG63/R（由MG63经ADM间断冲击法诱导产生）〔7〕，维甲酸（ATRA）为上海华联制药有限公司产品，人重组IL4购自晶美公司、足叶乙甙（VP16）北京制药厂、四甲基偶氮唑盐（MTT）华美生物工程公司、长春新碱（VCR）为上海化联制药有限公司、丝裂霉素C（MML）日本协和公司、鼠抗人Pgp（C219）单克隆抗体及地高辛标记的bcl2、P53的原位杂交试剂盒购自博士德公司。
   
　　1.2  细胞培养条件
   
　　细胞在37 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养，培养液为含10%的热灭活胎牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100 μg/ml的完全DMEM细胞培养基。48 h换液，细胞汇合时，用0.25%的胰蛋白酶/0.02% EDTA（1∶1）消化传代。
   
　　1.3  诱导肿瘤细胞分化
   
　　MG63（1×104/ml）细胞培养中分别加入ATRA（10-5mol/L）和IL-4(500 U/ml)，连续培养5 d后从形态学、生化代谢、瘤细胞增殖周期动力学方面评价细胞的性状。
   
　　1.4  Pgp检测Westenblot
   
　　取上述药物处理后的细胞及MG63/R、MG63，提取细胞总蛋白制备样品〔5〕，并配置SDSPAGE凝胶，行SDSPAGE凝胶电泳，将蛋白质电转移和膜封闭，封闭结束后，加入用漂洗液稀释的抗Pgp抗体（购自晶美生物工程公司）（1∶500）封口，孵育过夜；加入用漂洗稀释的碱性磷酸酶标记的二抗（1∶1 000）大量TBS漂洗液洗膜3次，各10 min避光用BCIP/NBT/Buffer（140 ml∶80 ml∶10 ml）显色。图像经Uvpgrabitimagel软件采集，Gelwords ID Advanced V 4.01软件处理分析。
   
　　1.5  细胞周期及凋亡分析采用流式细胞PI染色法
   
　　制备单细胞悬液［（4～7）×106/ml］用70%乙醇固定〔1〕，4 ℃保存，染色前用PBS进行离心沉淀去除固定液，加200 μl RNaseA 37 ℃水浴30 min，再加入100 μl PI染色液混匀，至4 ℃避光30 min，上机测试，记录激发光488 nm处红色荧光。
   
　　1.6  碱性磷酸酶活性的测定
   
　　细胞用胰酶消化后，重悬于10 mmol/L Tris·HCl（pH 7.4）含1 mmol/L KCl 30 mmol/L ZnCl2,0.1% Triton X-100，超声破膜30 s，后将处理后用4 ℃ 8 000 g离心后，用Lowry法检测ALP活性，并双宿脲法检测蛋白含量，单位为μmol/min/ngprotein。
   
　　1.7  肿瘤细胞药物敏感性的测定
   
　　采用MTT生物活性检测法，所获结果用加权线性回归法计算各药物对肿瘤细胞的抑制浓度（IC50）。
   
　　1.8  P53和bcl2表达水平检测
   
　　采用原位杂交分别检测P53和bcl2 mRNA。
   
　　其一般操作程序如下：标记指针用3端加尾法，标记成功后行标记探针效率检测。组织切片附在RNA酶及渡膜处理的玻片上，多聚甲醛固定，体积分数为0.1%的DEPC水处理，按1∶100浓度稀释探针进行杂交，时间24 h〔6〕。显色4 h后中性树脂或明胶封片，封片前不复染。
   
　　实验结果分析：半定量分析：染色后光学显微镜下数200个有核细胞，其中胞浆内棕黄色标记物着色者为阳性，计算阳性细胞百分数。阳性细胞≥15为该基因阳性，否则为阴性。定量分析：用HPLAS1000型全自动彩色图案分析系统对原位杂交结果进行定量测定，以平均光度作为量化指标。平均光度越大，阳性反应生物染色强度越强。
   
　　1.9  TUNEL末端标记法测定细胞凋亡
   
　　（TUNEL试剂盒购自晶美公司）按照说明书操作，并用核固红复发。
   
　　1.10  统计学处理
   
　　计量资料组间比较用t检验，计数资料两组间比较用x2检验和等级相关分析法（Pearson法）。用SPSS 10.0统计软件计算。
   
　　2  结果

　　2.1  经6 d的TRA及IL4诱导可见MG63由原来长梭形的细胞形态转变为大小不一的多边形，胞核变小，细胞浆增多。

　　2.2  Westenblot分析可见MG63/R，ATRA处理的MG63/ATRA中Pgp呈现高表达，而MG63及IL4处理的MG63/IL4的Pgp表达较低（图1）。经分化剂ATRA处理的MG63/ATRA表达Pgp增加，其渐变成为耐药状态。

　　图1Westenblot检测Pgp的结果（略）

　　A:亲本细胞MG63的Pgp表达情况

　　B：MG63耐药表型Pgp表达情况

　　C：ATRA处理的MG63的Pgp表达情况

　　D：IL4处理的MG63的Pgp表达情况

　　2.3  IL4、ATRA以及Mdr1对肿瘤细胞内P53、bcl2表达的影响及对凋亡的影响（表3，图3～6）
   
　　2.4  MG63分化特性的鉴定
   
　　碱性磷酸酶测定结果显示：MG63/R、MG63/ATRA、MG63/IL4细胞相对于亲本细胞MG63、ALP有显著性的增加（P＜0.05，图2）。细胞周期动力学分析显示S期细胞明显下降，瘤细胞主体群向G0/G1期移动，进入增殖周期的细胞明显减少。MG63/R、MG63/ATRA、MG63/IL4均出现了不同程度凋亡，但MG63/IL4的凋亡数显著的高于MG63/R、MG63/ATRA（表1，图7、8）。

　　图2碱性磷酸酶活性测定（略） 

　　碱性磷酸酶活性的单位为：μmol/min/ngprotein 1MG63 2MG63/R 3ATRA处理的细胞MG63/ATRA 4IL4处理的细胞MG63/IL4

　　2.5  肿瘤细胞药物敏感性的变化
   
　　MG63/R细胞同MG63/ATRA均对多种化疗药产生耐受，而经IL4处理后，MG63出现比亲本细胞更加敏感的状态（表2）。

　　表1  MG-63耐药表型及ATRA、IL-4对细胞周期分布的影响（略）

　　注：与亲本细胞MG-63细胞周期分布检测结果相比，*P＜0.05；**P＜0.01，可见，MG-63细胞转向耐药表型时同诱导分化剂处理的细胞相似均出现增殖能力下降、S期减少，但ATRA处理的细胞及MG-63耐药表型同亲本细胞比较其凋亡细胞百分率没有显著差异，有IL-4处理的MG-63明显出现凋亡。

　　表2  肿瘤细胞经处理后其药物敏感性的变化（略）

　　注：IC50为细胞半数抑制浓度单位为μg/ml，RF=IC50耐药细胞株/IC50亲本细胞；RF=IC50药敏细胞/IC50亲本细胞。

　　图3P53阴性细胞（INH  ×200）（略） 

　　图4P53阳性细胞（INH  ×200）（略） 

　　图5BCL-2阳性细胞（INH  ×200）（略） 

　　图6BCL-2阳性细胞（INH  ×200）（略） 

　　图7细胞凋亡TUNEL法核固红复染阴性（略） 

　　图8细胞凋亡TUNEL法核固红复染阳性（略）

　　表3  P53、Bcl-2在耐药状态及分化状态下的表达分析及凋亡（略）

　　注：与亲本细胞比较，IL-4处理的MG-63的Bcl-2 mRNA有明显的减少（P＜0.05），P53有显著的增强（P＜0.01），其凋亡细胞也呈明显增加，而耐药状态的MG-65/R及ATRA在各方面没有明显改变。

　　3  讨论
   
　　诱导分化剂是肿瘤治疗研究的当前热点，但研究显示在肿瘤诱导分化的同时会产生多药耐药现象，例如维甲酸〔9〕。以维甲酸为代表的分化诱导剂已应用于临床肿瘤的治疗并初显疗效。然而长期反复ATRA可以诱导Mdr1的表达，使细胞产生多药耐性，降低了疗效并限制了同其他抗肿瘤药物的配伍联合应用。这种分化状态是否同耐药存在着相关性。
   
　　本组试验应用ATRA、IL4〔5〕两种分化诱导剂处理细胞对比骨肉瘤的耐药表型MG63/R发现3种细胞亚系均呈现了分化，分化程度相似，均出现了碱性磷酸酶活性增高，细胞周期动力学S期受抑制等分化表现〔1〕。但在对化疗药物的敏感性及凋亡的发生率方面却差异很大。经ATRA处理后的分化细胞MG63/ATRA表现出了多药耐药性，经Westonblot检测显示PgP的表达明显增加，基本表现出了同MG63的耐药表型，MG63/R基本相似的生物学特征。且凋亡的发生率为（1.36±0.28）%，同MG63/R及亲本细胞MG63无显著性差异（P＜0.05）。而经IL4诱导的分化亚系PgP的表达及对药物的敏感性方面同亲本细胞间没有明显的改变。但凋亡细胞发生率却明显增高〔P＜0.05,（6.73±1.21）%〕。可见MG63分化过程中产生了两种状态，其中一种就是耐药状态。众所周知的细胞分化过程中根据生长动力学原理可以分为4个组群：（1）干细胞，它是肿瘤群体的起源，具有无限增殖及自我更新能力，大部分肿瘤细胞都处于这种状态。（2）过度细胞，由干细胞分化而来，具有无限增殖能力但丧失自我更新能力。（3）终末细胞，分化成熟细胞，已彻底丧失增殖能力。（4）G0期细胞，后备细胞。而作者认为耐药细胞是细胞分化过程中亚分化状态的一种特殊形式，即不仅存在着分化，也仍保留着肿瘤的无限增殖的特性。
   
　　Mdr同肿瘤细胞的凋亡之间的联系研究的很多，据认为多种细胞基因参与了肿瘤的多药耐药的调控，但细胞凋亡的调控机制，可能同Mdr的调控机制是不同的基因组。本实验组选择P53、bcl2两种比较经典的细胞凋亡的调控因子在骨肉瘤细胞学MG43的耐药表型主分化状态中的表达变化。可见在MG63/R及MG63/ATRA组中P53及bcl2的表达同亲本细胞株之间无明显的差异，而MG63/IL4组P53mRNA表达明显增加（P＜0.01）、bcl2 mRNA的表达明显降低（P＜0.05），而凋亡指数明显增加。
   
　　野生型P53（WtP53）在细胞生长过程中以“分子警察”的身份监视细胞内DNA状态〔4〕，P53对细胞耐药性的调节可能是双向的，具体作用方式与细胞种类、状态及药物作用特点及剂量有关系。而bcl2基因家族主要是抑制凋亡的作用，而其表达蛋白对肿瘤的药物敏感性的影响也是同样存在正负面的作用的。但两者同凋亡的表达存在着明显的相关性。可为什么诱导肿瘤细胞分化时却产生这样截然不同的结果呢？肿瘤细胞的耐药、分化、凋亡均是由多种基因调控的结果。而这些基因在调控中存在着交叉性，某些基因除调节细胞分化外也可能参与MDR基因表达的调节。如P53可以依赖性抑制MDR1基因启动子的活性，以抑制Mdr1的表达。但除P53、bcl2参与调节分化外Pgp的表达尚存在其他基因及产物调节其表达，故而P53、bcl2表达无变化时Pgp的表达出现了明显变化，但P53高表达时，Pgp表达也是明显受抑制的。可以看出P53同多药耐药MDR1基因的表达的关系是相对的。很多细胞内环境的因素决定着表达的关联性，例如细胞的状态、作用的药物，以及P53的畸变等〔10〕。
   
　　除了外排泵的功能外，MDR1/Pgp复杂的生物学行为及其调控机制至今尚不明了〔3〕。而分化过程中是否出现MDR，其机理是什么，一直存在争议。Tokura等利用ATRA诱导单核细胞性白血病细胞时也出现两种情况：一种分化、凋亡，一种分化、耐药〔6〕。可见从本实验及其他人的研究结果可以看出结论：多药耐药状态是一种亚分化状态，肿瘤细胞在分化过程中可能转化为多药耐药状态——一种低增殖但顽固抗药的状态。如何控制肿瘤定向分化，并诱导凋亡，逆转多药耐药值得进一步研究。
   

【参考文献】
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　　〔10〕 Scopes J,Massey HM,Ebrahim H.Interleukin4 and interleukin13:bidirectional effects on human osteoclast formation［J］.Bone,2001,29（3）:203208.

作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科，武汉 430030