椎间盘退变基因治疗的研究进展

【关键词】  椎间盘退变

    椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）可以引起一系列脊柱退变性疾病如椎间盘突出、脊柱不稳、神经根病变和脊髓病变等，目前的治疗方法主要是手术治疗，但手术方法只是处理终末期的症状，不能逆转疾病过程本身。因此国内外学者们一直致力于寻找一种能逆转这个疾病过程的方法，近来对椎间盘的生化构成及其内环境的进一步了解以及某些基因被发现对椎间盘内基质合成和分解有着重要的影响，这些为科学家寻求逆转这个疾病过程提供了新方法。为此，在过去几年里很多关注的焦点都集中在基因治疗上，并取得了预期效果。现就其研究近况综述如下。

    1  椎间盘退变的生物学特性

    椎间盘退变的确切机制还有待研究，但其过程大致是由于机械、营养、生物因素等各种因素造成损伤，导致椎间盘炎症介质增多、基质金属蛋白酶和其他蛋白水解酶含量及活性增加，引起细胞外基质降解，髓核细胞数目减少，进而使蛋白多糖、胶原的合成减少，使得髓核中蛋白多糖合成和分解不平衡，最终导致髓核中蛋白多糖和水分的净亏损，不能维持椎间盘内的张力，进一步加剧椎间盘的退变。因此通过增加髓核中蛋白多糖的含量来延缓或预防退变过程加剧是可行的。

    此外，椎间盘是一个被封住的结构，没有血管，其营养供应几乎完全依赖于其周边区域血管的扩散。这不利于它损伤修复，但这个封闭相对缺血的结构，可以避免在髓核中发生自身免疫反应。Nishida等〔1〕在对椎间盘用腺病毒进行萤光素酶基因传递的前数周，先把腺病毒注射到宿主皮下进行免疫，后发现椎间盘内萤光素酶的表达没有受到任何影响。这个结果显示椎间盘可能把载体及蛋白产物与免疫系统隔绝开来，使得这些外来载体和蛋白产物免受免疫系统的排斥。而这一直是困扰着体内其他组织的转基因表达，这就使基因疗法在椎间盘的应用比其他组织更具有优势。

    2  可选用的基因及其应用

    现在一般认为椎间盘退变主要是由于髓核内蛋白多糖的合成和分解不平衡引起的，因此可以从增加蛋白多糖的合成或抑制蛋白多糖的分解两方面入手，最终使蛋白多糖的含量增加，逆转退变过程。现已发现一些因子及其相应的基因对逆转这个过程可能是有益的。

    2.1  转化生长因子（TGF）

    早在20世纪90年代早期Thompson等〔2〕在体外用外源性TGFβ1处理犬的椎间盘细胞，结果蛋白多糖合成显著增加。后来Nishida等〔3〕以腺病毒为载体，在体内把TGFβ1基因转染健康兔子的髓核细胞。这些兔子分别在1~6周后先后被杀，单独对髓核细胞进行分析显示有活性和总的TGFβ1都急剧的增加，与那些没有转染的细胞和转染了萤光素酶标记基因的细胞相比蛋白多糖总量增加了1倍。接着，Moon等〔4〕用含有TGFβ1的腺病毒载体在体外转染人椎间盘细胞结果显示蛋白多糖和胶原合成有显著增加，与导入标记基因的细胞相比，增加了达3倍之多。Makarand等〔5〕取出鼠整个椎间盘（包括软骨终板、纤维环、髓核）在含有TGFβ1或TGFβ 3的培养基中培养，1周后结果显示椎间盘的大体结构保存，无髓核细胞死亡的证据，但与TGFβ1相比，TGFβ3更能提高关键性基质的合成，保持转化生长因子受体表达，降低胶原转型等。

    2.2  骨形态发生蛋白（BMP）

    目前研究BMP家族成员包括有BMP2、BMP7、BMP13等。Li等〔6〕人在体外用外源性BMP2处理鼠的椎间盘细胞，不仅使得椎间盘中的聚集蛋白聚糖表达增加，还促进了OP1（成骨蛋白1）的表达。BMP7也称OP1，Takegami等〔7〕用兔的髓核和纤维环细胞实验，显示OP1不仅促进蛋白多糖的合成，而且还能恢复由IL1造成的蛋白多糖的丢失。Jesse等〔8〕人在兔子髓核内注射OP1结果显示了OP1可以部分恢复退变椎间盘的高度和黏滞性，同时也使髓核的湿重增加，DNA、蛋白多糖和胶原的含量都增加。BMP13也成为GDF6（生长分化因子6）或者也称为CDMP2（软骨源性形成蛋白2）。虽然它属于BMP家族，但它的氨基酸序列只有50％与BMP2同源。用软骨细胞株进行实验〔9〕显示BMP13能促进蛋白多糖的合成，保持软骨细胞表型，但它的作用明显弱于BMP2。如果同时给予BMP2，BMP13则显示两者对促进蛋白多糖合成或软骨细胞基因表达有叠加效应，但无协同作用。

    2.3  生长分化因子5（GDF5）

    也称为软骨源性形成蛋白1（CDMP1），在胚胎形成时，它主要存在于形成软骨的间质内和形成长骨过程中的软骨核心。Walsh等〔10〕比较了GDF5、TGFβ1、IGF1、FGF4种因子对鼠椎间盘退变模型的治疗作用，结果显示只有GDF5与对照组相比能增加椎间盘高度，此外在组织切片中发现它能使内纤维环和移行带的细胞数目增加。Wang等〔11〕在体外用腺病毒传递GDF5发现它能促进细胞的增殖。

    2.4  促有丝分裂因子

    它包括胰岛素样生长因子（IGF1），表皮样生长因子（EGF）和成纤维生长因子（FCF）。Thompson等〔2〕在体外用成年狗的椎间盘细胞显示这些促有丝分裂因子都能促进蛋白多糖合成，但总体来说，EGF的这个作用比其他的因子更为显著。Osada等〔12〕用外源性IGF1促进牛细胞蛋白多糖的合成，此外还发现在培养过程中细胞可以通过自分泌或旁分泌影响别的细胞，这种现象好像具年龄相关性，在年轻椎间盘的细胞中这种现象表现的更突出。

    2.5  CJun

    称为即刻早期原癌基因，参与多种细胞的增殖和生物合成调节过程，它是一个能够修复退变椎间盘很有希望的基因。Behrends等〔13〕的研究结果显示，敲除小鼠的CJun基因，可以使其中轴骨骼发育严重畸形和脊索细胞基因突变，表现为细胞凋亡的增加，最终导致椎间盘细胞数目的急剧减少。

    2.6  连接蛋白的合成肽（synthetic peptide of link protein，LinkN）

    它是一种连接蛋白的氨基末端片断。Mwale等〔14〕发现其对椎间盘细胞有明显的刺激蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成作用，但它无促进细胞数量增殖的作用。

    2.7  LIM矿化蛋白

    LMP1是一个重要的胞内调节蛋白，最初发现它能促进骨形成和成骨细胞分化，现在发现它还能影响BMP家族蛋白，上调他们的表达和提高他们的合成〔15〕。Yoon等〔16〕用含有LMP1基因的腺病毒载体在体内外转染鼠椎间盘的纤维环和髓核细胞结果显示蛋白多糖总量和聚集蛋白聚糖的合成都增加。此外在体外的实验结果还显示出BMP2和BMP7 mRNA显著增多，进一步的抑制实验证明LMP1实际上是通过BMP介导的机制上调胞外基质合成。

    2.8  SOX9基因

    SOX9基因是软骨形成过程中一个重要的转录调节因子。Paul等〔17〕实验证明了在体外用含有SOX9基因的腺病毒转染人髓核细胞后，Ⅱ型胶原mRNA和蛋白合成都有增加。在同样的实验背景下，把SOX9基因导入行纤维环切开术后的新西兰大白兔腰椎间盘内，被转染的髓核细胞仍保持着软骨细胞表型，而对照组中正常髓核细胞被纤维细胞所取代。由于髓核软骨样细胞数目的下降被认为会引起椎间盘退变，这提示了SOX9基因可能对椎间盘退变有治疗作用。最近Gruber〔18〕等人研究发现SOX9基因随年龄的增长而衰变加重，在人椎间盘纤维环细胞中的表达也逐渐递减。这进一步的说明了SOX9基因在椎间盘退变中的作用。

    2.9  基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）

    基质金属蛋白酶家族能降解细胞外基质，椎间盘软骨样细胞主要分泌MMP1、MMP2、MMP3、MMP9〔19〕，MMP3（基质降解酶）在IVD中特别活跃，在退变的椎间盘中它比它的天然抑制物——（TIMP1）含量更丰富〔20〕。从理论上讲，通过上调TIMP1的合成来抑制MMP3的活性降低基质的分解，最终引起椎间盘中蛋白多糖含量的增加。确实，Wallach等〔21〕证实了用含有TIMP1的腺病毒在体外转染人髓核细胞引起了蛋白多糖含量增加，这个结果与BMP2所诱导的结果相一致。

    3  载体的选择及其安全性

    要应用基因疗法来治疗椎间盘退变则必须要有一个基因传递载体，能在体内或体外把目的基因导入靶细胞。现在使用的载体主要分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体能避免转染载体的播散和降低宿主对载体的免疫反应，对其研究在过去十年里获得很大的发展〔22〕，但是它仍受到转染率不高、基因表达时间短的困扰。而病毒由于能够侵入人体细胞并影响转录和翻译，因此最常被用来做为基因传递载体。病毒载体可以分为2类，一类是可以把基因整合到宿主染色体内，如反转录病毒和腺相关样病毒（AAV）。另一类则不把基因整合入宿主细胞的染色体，如腺病毒。逆转录病毒整合到宿主细胞基因组时，理论上可以把目的基因传递给子代细胞而增加表达时间，但这种病毒不感染静止细胞如髓核细胞，而且可能有致癌危险，这限制了它在椎间盘退化基因治疗中的应用。而腺病毒既不与宿主基因组整合，也不能把目的基因传递给宿主细胞的下一代，但它在可转染分裂细胞和不可分裂细胞而且转染率高。因此很多椎间盘退变基因治疗的研究都用腺病毒。但是它表达的时间短，而且免疫原性强，可能对机体造成不利的影响。AAV在转染效率方面可能不如腺病毒，但它致病性弱，免疫原性弱，能转染很多组织，基因表达的时间长，使得它在治疗椎间盘退变方面倍受关注。初步的研究结果还不错，一项研究〔22〕显示用AAV作为载体可使基因在体内表达最少持续6周，而且每隔2周表达的量会增加一次。

    虽然近年来一些实验应用病毒载体在动物身上取得了一系列可喜的效果，但真正要应用于临床还必须考虑其安全性问题。特别是应用于椎间盘，因为神经组织离椎间盘很近，如果损伤了就可以导致神经损害。有研究已经阐述了这种载体可能存在的副作用。在一些没有公开发表的资料，Wallach等人在新西兰大白兔的硬膜下间隙分别注入治疗量和超治疗量的含有TGFβ1或者BMP2基因的腺病毒载体（Wallach CJ，Kim JS，Sobajima S.Safety assessment of intradiscal gene transfer.Department of Orthopaedic Surgery，University of Pittsburgh Medical Center，2002）。对这2组兔子及其髓核进行临床和组织学的分析，发现2组有明显的不同。接受治疗量组没有临床症状，脊髓与正常对照组相比无异常。而接受超治疗量的实验组发展为双下肢瘫痪，明显的组织学改变包括脊髓黑白质边界变形，硬脊膜明显纤维化等。虽然这项实验指出了宿主对治疗范围的病毒量有很好的耐受，但它同时也指出了对病毒载体的滥用和误用有潜在的危险性。

    4  基因表达的调控

    基因治疗过程中，所表达的目的基因产物总量需要控制，如果持续表达则可造成表达产物过量从而引起毒副作用。有鉴于此，研究人员已经开始研究基因表达调控系统，现在用的较多的是”Teton”系统（四环素调控系统），它是在靶细胞内的目的基因连接一个配体活化启动区做为基因开关，应用四环素衍生物做为配体来激活转基因的表达。最近把该系统整合到腺病毒载体使其在体内外的调控效率和反应速度上都有显著的改善〔24〕。虽然这个系统在某些情况下诱导基因表达的反应较慢，但是去除配体后它能使转基因表达快速停止，这可能在一些慢性疾病如椎间盘退变的治疗是有用的。最近Ueblacker等〔25〕用“Teton”系统成功的对新西兰大白兔膝关节软骨细胞中标记基因的表达进行调控。虽然没有直接应用于椎间盘，但研究表明这个调控系统在骨科领域的可应用性，指出了在椎间盘退变中进行转基因调控的可能性。

    5  未来方向

    虽然关于应用基因治疗椎间盘退变的一些基础性研究结果令人兴奋，但是基因疗法要最终从实验室向临床过度还需解决很多问题：（1）进一步了解椎间盘退变的生物学机理，对目前认为能够逆转椎间盘退变的生长因子和其他一些蛋白的基因进一步研究，以期待能获得最佳的治疗基因。（2）构建高效安全的基因载体。虽然腺病毒已广泛应用于研究，但它的安全问题将阻碍它在人类临床试验的广泛应用。AAV还未在椎间盘进行充分的研究，但由于它本身的一些优点，它不失为一个好选择。此外，非病毒载体与病毒载体相比少了一些风险。近来的研究使得病毒和非病毒基因传送技术已经取得了一定的进展，但仍需不断的发展，这是未来基因治疗研究的重要任务。（3）构建出高效安全的基因调控系统，避免在基因治疗中可能产生的毒副作用〔26〕。Toniatti等〔27〕认为理想的调节系统必须具备几点：即它的特异性，生物利用度，诱导复合物的安全性、可逆性、剂量依赖性等。目前虽然取得了一些进展，但这类理想的转基因调控系统还没研制出来，对它的进一步研究对椎间盘退变的基因治疗具有重要意义。我们相信随着国内外学者们的不懈努力，对椎间盘退变进行基因治疗中存在的问题将会逐一被解决，使其最终在临床上得以应用。

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作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022