改良大鼠气囊模型在人工关节假体松动研究中的应用

【摘要】  ［目的］设计并改良大鼠气囊模型（the air pouch model）,证实该模型在人工关节松动相关研究中的应用价值。［方法］（1）改良大鼠气囊模型的建立：健康成年SD大鼠18只，背部皮下注入空气20 ml, 48 h后补充注入空气10 ml形成气囊。形成气囊24 h后气囊穿刺，注入PBS液5 ml，6、24、48 h分别穿刺抽液，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF-α;（2）改良大鼠气囊模型对不同关节材料磨损颗粒生物反应的比较：健康成年SD大鼠24只，皮下充气造模后将钴铬钼、钛铝钒和钛铌锆合金（TNZ）颗粒混悬液注入气囊，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF-α，用囊壁组织学切片进行炎症细胞反应分级并测量囊壁厚度。［结果］（1）在SD大鼠皮下注入空气20 ml可以形成饱满的气囊，大鼠术后活动正常。48 h后气囊由于气体吸收体积减小，张力下降。再次注射10 ml空气后张力恢复。PBS能使囊内液体的TNF-α在6 h左右出现一个高峰达239.30 pg/ml，与24 h和48 h比较，差异有显著统计学意义（P<0.05）。IL-6的测定值没有TNF-α那样的6 h分泌高峰。6、24、48 h之间无显著性差异（P>0.05）；（2）钴铬钼、钛铝钒、TNZ 3种颗粒注入气囊48 h后都能引起TNF-α分泌量显著升高（P<0.05），两两比较，钛铝钒组明显高于钴铬钼组和TNZ组（P<0.05）。3种材料均不能引起IL-6分泌的显著增加（P>0.05）。TNZ组气囊囊壁厚度明显小于钴铬钼组和钛铝钒组（P<0.001）。［结论］改良大鼠气囊模型具有造模简单、对人工关节颗粒反应快速敏感的特点，是一种人工关节松动相关实验研究有效的动物模型。

【关键词】  人工关节； 生物相容性材料； 模型； 体内研究

   Modified rat air pouch model for experimental studies on loosening joint prosthesis∥JIA Qing-wei, DAI Ke-rong TANG Ting-ting, et al. Department of Orthopaedics, No.9 Affiliated Hospital of Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200011, China

    Abstract：［Objective］To design a new modified rat air pouch model to be used in experimental studies on joint prosthesis loosening.［Method］(1)18 SD rats were used in the modified air pouch model experiments. 20 ml air was injected subcut aneously on the back of rats to form the pouches and 10ml air was re-injected after 48 hours to keep the pouches full. 5 ml PBS liquid was injected after another 24 hours. The liquid in the pouches was harvested in 6, 24, 48 hours respectively for IL-6 and TNF-α by ELISA procedure and the capsules for histology examination. (2) Ti-6Al-4V, Co-Gr-Mo and new bate titanium alloy made of titanium; niobium and zirconium (TNZ) were chosen in prosthetic loosening experiment. Particles(2.5×107/ml) of 3 candidates were injected into the air pouches. The liquid in the pouches was collected 48 hours later for IL-6 and TNF-α by ELISA procedure and the capsules for histology examination. The thickness of pouches was compared to each other.  ［Result］ (1) 20ml air can form a pouch successfully. 10ml air can keep the pouch full after 48 hours. The pouches stimulated by PBS liquid to excrete more TNF-α at 6 hours(239.30 pg/ml) than those at 24 hours and 48 hours(P<0.05). There was no statistical difference in IL-6 excretion. (2)TNZ, Ti--6Al-4V and Co-Gr-Mo particles made the air pouches secret more TNF-α compared with the control (P<0.05). Ti-6Al-4V particles made the effect more prominent than the others (P<0.05). This effect was not seen in IL-6 menstruations experiments. The thickness of the air pouches was different in the three groups. It was thinner in the TNZ group than that in the others (P<0.001). ［Conclusion］The modified air pouch model developed in author's lab is a simple, sensitive and effective model for joint prosthesis loosening experiments.

    Key words：artificial joint;  biocompatible materials;  model;  in vivo

    人工关节假体晚期松动是长期困扰人工关节发展的难题。假体材料磨损颗粒引发的巨噬细胞介导的破骨细胞性骨吸收是晚期松动的主要生物学原因［1］，IL-1、IL-6、TNF等细胞因子对破骨细胞的发生、成熟、分化有重要作用［2］。在假体松动研究中，一直缺乏有说服力的体内动物实验模型。本实验中将关节炎研究中常用的气囊模型（the air pouch model）进行改良用于假体松动研究，初步证实其应用价值。

    1  材料与方法

    1.1  大鼠气囊模型 (the air pouch model) 的建立

    健康成年SD大鼠18只，背部皮下注入空气20 ml, 48 h后补充注入空气10 ml形成气囊。形成气囊24 h后气囊穿刺，注入PBS液5 ml，6、24、48 h分别穿刺抽液，收集囊内液体，-75℃冻存备用（图1）。

    囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF-α。测定用ELISA试剂盒购自BioSource U.S.A。操作程序按试剂要求进行。

    1.2  人工关节磨损颗粒混悬液的制备

    方法参见贾庆卫等，人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究［３］。

    1.3  大鼠气囊模型对各种金属颗粒的生物学反应观察

    健康成年SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只。分笼饲养2周无疾病表现者进入实验。氯胺酮腹腔麻醉，背部75%酒精消毒，皮下注入空气20 ml, 形成皮丘。48 h后气囊穿刺，再次注入空气10 ml。24 h后分别注入钴铬钼、钛铝钒、TNZ颗粒混悬液5 ml（颗粒浓度2.5×107/ml），48 h后穿刺抽液，收集囊内液体，-75℃冻存备用。

    囊内液体采用ELISA方法测定IL-6和TNF-α。测定用ELISA试剂盒购自BioSource U.S.A。操作程序按试剂要求进行。

    1.4  大鼠气囊模型对各种金属颗粒的组织学反应观察

    48 h后大鼠颈椎脱臼法处死，背部正中切口，将气囊完整摘除，4%甲醛固定1周，脱水、透明、石蜡包埋，连续切片，厚度5 μm，常规HE染色，光镜观察。重点观察反应膜中的细胞构成，并按国家标准GB/T16175-1996中植入实验炎症细胞反应分级标准进行分级（表1）。表1  GB/T16175-1996材料植入实验炎症细胞反应分级标准（略） 在放大100倍光镜下与显微标尺（10 μm）共同拍照，获得图像输入计算机，利用UTHSCSA ImageTool 3.00图像处理软件测量囊壁厚度。先利用标尺校准测量长度为10 μm，在囊壁处随机选取6个测量点，则可以读出每个测量点的厚度数值。

    1.5  统计学分析

    实验测量结果经SAS6.12软件处理。组内各参数之间的比较用方差分析，两两比较用q检验，以P<0.05表示差异有显著意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

    2  结果与分析

    2.1  大鼠气囊模型的建立

    在SD大鼠皮下注入空气20 ml可以形成饱满的气囊，大鼠术后活动正常。48 h后气囊由于气体吸收体积减小，张力下降。再次注射10 ml空气后张力恢复（图1）。

    采用ELISA方法测定囊内液体TNF-α的结果显示：PBS能使囊内液体的TNF-α在6 h左右出现一个高峰达239.30 pg/ml，与24、48 h比较，差异有显著统计学意义（P<0.05）。

    IL-6的测定值没有TNF-α那样的6 h分泌高峰。6、24、48 h之间无显著性差异（P>0.05）（表2）。表2  PBS刺激气囊分泌TNF-α和IL-6与刺激时间的关系（略）

    2.2  大鼠气囊模型对金属磨损颗粒的生物学反应观察

    钴铬钼、钛铝钒、TNZ 3种颗粒注入气囊48 h后都能引起TNF-α分泌量显著升高（P<0.05），两两比较，钛铝钒组明显高于钴铬钼组和TNZ组（P<0.05）。

    3种材料组的IL-6分泌量均高于空白对照组，以TNZ组更为明显，但各组间无显著差异（P>0.05）(表3)。表3  钴铬钼、钛铝钒、TNZ气囊TNF-α和IL-6分泌量的比较（略）

    2.3  大鼠气囊模型对各种金属颗粒的组织学反应观察

    气囊组织学显示：作为空白对照的气囊囊壁镜下为紧贴肌肉内层的纤维结缔组织膜，主要由纤维组织和成纤维细胞构成，囊壁内可见少量的淋巴细胞，炎症细胞反应为Ⅱ级（图2）。

    钛铝钒组囊壁明显增厚，可见少量的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，炎症细胞反应为Ⅲ级（图3）。

    钴铬钼组气囊成纤维细胞增生活跃，可见分裂相、血管增生和脂肪坏死，炎症细胞反应为Ⅲ+级（图4）。

    TNZ气囊较薄，炎症细胞反应为Ⅲ级（图5）。

    各种金属材料气囊囊壁厚度：钴铬钼组>钛铝钒组> TNZ组>空白对照组。两两比较，每两组间均有明显差异P<0.001(表4)。表4  各种金属材料气囊囊壁厚度测量数值（略）  图1  大鼠气囊模型的建立  图2  囊壁组织光镜下形态囊壁镜下为紧贴肌肉内的纤维结缔组织膜，主要由纤维组织和成纤维细胞构成，囊壁内可见少量的淋巴细胞，炎症细胞反应为Ⅱ级（HE染色，100×）  图3  钛铝钒组囊壁光镜下形态，明显增厚，可见少量的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，炎症细胞反应为Ⅲ级（HE染色，100×）  图4  钴铬钼组囊壁可见成纤维细胞增生活跃，可见分裂相、血管增生↑和脂肪坏死，炎症细胞反应为Ⅲ+级（HE染色，100×）  图5  TNZ气囊轻度增厚，炎症细胞反应为Ⅲ级（HE染色，100×）

    3  讨  论

    3.1  大鼠气囊模型 (the air pouch model) 的应用

    Edwards首先描述了在动物皮下注入空气形成的体内组织培养模型用于关节炎的研究。至今为止，此模型仍然是各种炎症相关研究中最活跃的体内动物实验模型［４］。Gelb将此方法应用于人工关节假体松动的研究得出著名结论：颗粒的表面积是决定其组织反应的关键因素。Wooley［５］采用此模型对UHMWPE、PMMA、TiAlV、CoCrMo 4种假体材料的生物相容性进行对比评价，首次发现不同材料在引发机体炎症反应时有协同作用。Ren［６］证实经颗粒刺激的气囊能在体外组织培养中促进骨吸收，这种作用与关节假体周围的骨溶解非常相似。Yang［７］也采用此方法得出结论：颗粒形状是影响囊壁细胞凋亡的重要因素。IL-1受体拮抗剂在此模型中能明显减少巨噬细胞聚集和局部炎性因子的分泌，腺相关病毒介导的骨保护素转基因技术在气囊模型中能减轻骨的吸收。总之气囊模型已初步应用于：(1)关节假体松动机理的研究；(2)治疗、预防假体松动药物及方法的筛选；(3)新型生物材料生物相容性的比较和评价［８，９］。

    作者在引进时将此模型进一步改良，主要是以SD大鼠（体重200 g左右）替代小鼠，从而实现了20 ml气囊（原气囊为3 ml）。提高了实验的成功率，可以为实验提供更多的囊内液体和囊壁组织供多因素分析。实验证明这种改良是成功的。在应用中作者体会该模型有下列优点：(1)模拟性强，研究证实气囊与松动假体周围界膜的组织形态、细胞构成相似，囊内液体的细胞成分、炎性因子与假体周围液体近似；(2)实用性好，各种生物材料颗粒都能有效引发气囊产生细胞反应和体液反应，囊壁厚度、囊液细胞含量、细胞因子等指标都能定量测定；(3)敏感性好，尤其是对于材料颗粒的成分、大小、表面积、表面形态等特性都有敏感的反应；(4)造模简单、节约时间和费用。

    本研究在使用气囊模型中发现：(1)PBS液体能使囊内液体的TNF-α在6 h左右明显升高，24、48 h回复到较低水平。这一现象在以往的文献中未见报告，可能为气囊造模过程中的物理性刺激导致。IL-6的测定值没有TNF-α那样的6 h分泌高峰。因此认为，颗粒注入后48 h是获取结果的合适时期。(2)钴铬钼、钛铝钒、TNZ 3种颗粒刺激气囊48 h后都能引起TNF-α分泌量显著升高（P<0.05），钛铝钒组明显高于钴铬钼组和TNZ组（P<0.05）。3种材料均不能引起IL-6分泌的显著增加。因此气囊模型中检测TNF-α的敏感性相对较好。(3)气囊的组织学改变也是反应材料生物相容性的客观指标。

    气囊模型的最大的缺点是没有骨组织的参与，因此不能直接观察到骨溶解的现象。解决问题的设想有：(1)将气囊模型与骨组织体外培养模型结合起来，即材料颗粒刺激气囊，囊液/囊壁组织在骨组织培养中表现溶骨；(2)将同种异体骨块置于气囊中观察溶骨［７］，但是植入无血运的骨块并不能很好地模拟体内情况；(3)有作者表达了在股骨头内建立气囊模型（particulate-stimulated femoral head air pouch model）的设想［６］，但是没见到应用报告。

    3.2  TNZβ钛合金的生物相容性研究

    本研究中采用的钛铌锆合金（TNZ）是一种具有全新结构的β型钛合金。β型钛合金生物相容性更好、弹性模量更低，因此成为骨科生物材料研究的热点。β钛合金的发展趋势是选用生物相容性更好的元素，这是β钛合金生物相容性优良的物质基础。早期的β钛合金用钼取代了有细胞毒性的钒和铝。现代的β钛合金则倾向于选取生物相容性更好的铌、锆、铊、钸等元素，如国内外相继研制的Ti-13Nb-13Zr、Ti-Zr-Nb-Ta-Pd和Ti-15Mo-5Zr-3Al都具有优良的生物相容性。近期的研究表明，通过生物相容性元素Nb 、Ta、 Zr的严格组合可使潜在的组织反应达到最小。本研究证明了作者在国内首次研制的TNZ合金优良的细胞相容性、组织相容性，说明TNZ将有望减少假体周围骨溶解，防止人工关节假体的松动。因此有广泛的应用前景。

【参考文献】
  ［1］ 贾庆卫, 孙俊英. 破骨细胞性骨溶解与关节假体无菌松动［J］.江苏医药, 2002, 8: 619-620.

［2］ 张超，汤亭亭，戴克戎.人工关节无菌性松动药物治疗进展［J］. 中国矫形外科杂志，2007，11: 836-839.

［３］ 贾庆卫，汤亭亭，严孟宁，等.人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2007,24:1888-1892.

［4］ Moisan E, Chiasson S, Girard D. The intriguing normal acute inflammatory response in mice lacking vimentin［J］. Clin Exp Immunol， 2007， 3.158-168.

［5］ Wooley PH, Morren R, Andary J, et al. Inflammatory responses to orthopedic biomaterials in the murine air pouch［J］. Biomaterials, 2002，2:517-526.

［6］ Ren W, Wu B, Mayton L, Wooley PH. Polyethylene and methyl methacrylate particle-stimulated inflammatory tissue and macrophages up-regulate bone resumption in a murine neonatal calvarias in vitro organ system［J］. J Orthop Res, 2002，5:1031-1037.

［7］ Yang SY, Ren W, Park Y, et al. Diverse cellular and apoptotic responses to variant shapes of UHMWPE particles in a murine model of inflammation［J］. Biomaterials,2002，17:3535-3543.

［8］ 贾庆卫, 孙俊英, 江宏卫, 等.碳增强的聚醚醚酮作为髋臼假体材料的实验研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2003,3、4:210-213.

［9］ 贾庆卫, 孙俊英,孙　康,等.碳增强的聚醚醚酮全髋假体复合材料的实验研究［J］.中国矫形外科杂志,2003,18:224-226.

作者单位：上海交通大学附属第九人民医院骨科，上海 200011