定向分化神经前体细胞移植治疗脊髓损伤

【关键词】  脊髓损伤

    脊髓损伤(spinal cord injuries,SCI)导致神经细胞死亡、轴突断裂、神经传导功能障碍。中枢神经系统(central nervous system,CNS)内神经元属于分化成熟细胞，死亡后很难自行修复，目前尚无有效办法恢复损伤脊髓的神经功能［1］。近来研究表明细胞移植在脊髓损伤治疗中有良好前景。干细胞具有多向分化潜能和无限增殖能力，因而干细胞移植在细胞移植策略中有着重要意义。近年来，研究发现多向分化潜能的干细胞在移植环境内(如脊髓损伤)其分化过程受多种因素影响。研究表明，定向分化的神经前体细胞(或干细胞预分化)可以促进移植细胞有利分化，可能有助于提高细胞移植治疗脊髓损伤的效果。

    1  神经干细胞的分化

    CNS形成和其它系统一样，系统发育过程中总是伴随细胞的增殖、分化和成熟。类似血液系统发生，CNS发生过程中也存在多向分化潜能的干细胞和定向分化的祖细胞、前体细胞等不同分化程度的细胞群。

    原始神经上皮变为成熟神经细胞过程中，细胞越成熟则分化潜能越小，最终形成高分化的成熟神经细胞。神经元及神经胶质细胞的形成过程必需经过定向分化的神经前体细胞阶段［2］。

    目前，研究发现两种不同性质神经干细胞。一种为表皮生长因子依赖性神经干细胞，呈细胞球团状生长，又称神经球。可从小鼠胚胎期(E14)CNS分离，呈nestin阳性，能自我更新，分化形成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。培养生长依赖表皮生长因子，成纤维细胞生长因子不能单独维持其生长［3］。另一种为成纤维细胞生长因子依赖性神经干细胞，可从胚胎期(E10.5)小鼠神经管分离，亦能自我更新，分化形成三大类神经细胞。可在细胞悬液内或培养皿上生长，表皮生长因子不能代替成纤维生长因子进行细胞培养、分离［4］。

    CNS发育过程中还存在多种分化程度更高的神经前体细胞。少突胶质细胞-2型星形胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte-type 2 astrocyte precursor,O2A)为一类胶质前体细胞，可从新生大鼠视神经、皮层及脊髓分离。O2A可分化为少突胶质细胞和2型星形胶质细胞，但不能形成神经元。O2A进行体内移植后可分化为少突胶质细胞［5］。星形胶质前体细胞是另一类胶质前体细胞，可从胚胎期(E16)小鼠小脑内分离，不表达神经胶质酸性蛋白，培养依赖表皮生长因子，可分化形成星形胶质细胞，表达A2B5标记，不能产生少突胶质细胞，提示星形胶质前体细胞与O2A为两种不同的胶质前体细胞［6］。定向分化的胶质前体细胞(glial-restricted precursors,GRP)为另一类胶质前体细胞，可来源于发育阶段脊髓，同时呈A2B5和nestin阳性。GRP与O2A不同，GRP可形成两种星形胶质细胞，O2A只产生一种星形胶质细胞［5,7］。此外，还有神经元定向分化的前体细胞，表达E-NCAM标记，其形态与神经上皮细胞、神经嵴细胞、胶质前体细胞均不相同。培养可维持前体细胞未分化状态，能分化成熟为多种神经元，不能产生少突胶质细胞和星形胶质细胞［8］。

    神经细胞成熟经历了早期未分化的多能干细胞阶段，分化形成各种神经前体细胞，最后产生成熟的神经细胞。神经细胞发生在时间、空间上有着严格顺序，不仅与神经细胞自身分化状态有关，同时也受微环境影响［4,8,9］。因此，在细胞移植治疗脊髓损伤中应考虑到干细胞所处的分化(成熟)阶段。一方面干细胞分化潜能大，另一方面也应注意到移植(损伤)环境能否提供干细胞存活、分化的有利条件，以及如何控制移植细胞朝功能性神经元、髓鞘形成细胞分化(如少突胶质细胞)［10］。

    2  移植微环境因素对移植细胞分化的影响

    移植细胞在体内的分化命运不仅与自身分化阶段有关，同时也受移植微环境的影响。成体CNS神经发生区域主要位于(脑)室下区域、海马、齿状回及中央管周围。脊髓神经干细胞可培养分化成三大类神经细胞。但移植到损伤脊髓内往往分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞，提示损伤脊髓微环境中移植的干细胞沿胶质细胞系分化。然而，干细胞移植到脑内神经发生区域则可分化形成神经元。研究表明，多能干细胞体内的分化行为受到移植环境的影响［11,12］。

    有研究报道，将人神经干细胞移植到成年大鼠正常纹状体-黑质区域，移植细胞主要分化为星形胶质细胞［13］。将成体神经干细胞移植到嗅球神经发生区域则可形成大量神经元［14］。同样，将人多向分化潜能神经细胞移植到成年大鼠脑内室下区、海马区，移植细胞可沿内源神经元前体细胞迁移途径移行，并在嗅球颗粒区、海马齿状回形成神经元［15］。成年大鼠海马内分离的干细胞移植到大鼠海马区域，发现齿状回中移植细胞形成海马神经元，而移植到非神经发生区则形成胶质细胞。可见，CNS不同移植部位的微环境影响着移植干细胞的分化命运。

    移植微环境对干细胞分化的影响，给干细胞移植治疗脊髓损伤带来巨大挑战。研究显示干细胞移植治疗CNS损伤时，移植细胞通常分化为胶质细胞(以星形胶质细胞为主)。人神经干细胞移植到帕金森病大鼠纹状体，移植2周后可见移植细胞迁移，20周时仅剩余少量移植细胞，且主要为星形胶质细胞［16］。神经干细胞移植到成年小鼠新生皮层变性区域，15%±7％移植细胞呈类锥体细胞形态，轴突延伸并形成突触连接。相反，上述细胞移植到成年小鼠正常或化学损伤的新生皮层中，移植细胞则形成胶质细胞［17］。复杂的损伤环境中移植的干细胞可能更加容易沿胶质细胞系进行分化。

    有研究比较了大鼠神经干细胞移植到正常或损伤脊髓环境内细胞分化情况。移植至正常脊髓后，可见细胞存活和分布在移植部位1.5～2 mm范围内。移植8周后，14％细胞呈nestin阳性，51％呈神经胶质酸性蛋白阳性，mAb328阳性少突胶质细胞为7％，未发现NeuN阳性神经元存在。神经干细胞移植到成年正常脊髓中，移植细胞沿胶质细胞系分化，以星形胶质细胞为主，未见神经元形成。进一步研究干细胞移植到大鼠脊髓(T7～9)挫伤部位，移植8周后神经胶质酸性蛋白阳性细胞比例为35％，而nestin阳性细胞为20％，始终未发现mAb328或NeuN阳性细胞。研究结果提示，脊髓损伤环境中未分化干细胞比例较高，分化成星形胶质细胞为主，少突胶质细胞分化受到抑制［18］。

    此外，有研究观察了神经前体细胞系(RN33B)移植到大鼠海马区域(正常侧和损伤侧)的分化情况。移植7周后损伤侧可见明显的胶质反应和移植细胞的存活。正常海马和损伤较轻的海马区域，移植细胞呈神经元表型。海马严重损伤区域内移植细胞则表现双极或多突起的细胞形态，未见神经轴突存在。研究结果提示，分化程度较高的神经前体细胞在损伤环境中有可能分化为神经元。因此，推测在细胞移植前将干细胞预先分化或直接移植定向分化的神经前体细胞，可能有利于控制(损伤环境内)移植细胞的分化［19］。

    3  细胞分化阶段对移植效果的影响

    CNS内直接移植干细胞不易控制其分化，细胞分化明显受移植微环境影响。复杂的损伤环境中干细胞往往沿胶质细胞系分化。如何控制移植细胞的分化过程逐步成为提高细胞移植治疗CNS损伤效果的关键所在。研究表明细胞自身分化(成熟)状态也对移植细胞的分化有着影响。将胚胎期(E16)海马神经干细胞移植到成年小鼠新生皮质或损伤皮质内未见神经元形成［20］。将胚胎期(E17)小鼠皮层内更成熟的神经细胞移植到新生小鼠大脑新生皮层变性区域，可见移植细胞存活、迁移，呈成熟锥体细胞形态并与宿主细胞结构整合。研究提示，细胞自身分化程度在一定程度上也影响着移植细胞在移植环境中的分化。

    将人神经干细胞移植治疗大鼠黑质-纹状体病变，发现移植后干细胞少量存活。若将移植细胞预先培养10 d再移植，移植细胞存活率提高，且有成熟神经元分化形成。干细胞直接移植到病变纹状体不形成神经元，而移植前将干细胞预先分化处理后，移植细胞存活更好且分化形成神经元［21］。另有研究报道，将人胚胎干细胞培养形成神经元和胶质细胞后，移植到大鼠纹状体损伤区域，观察到移植细胞存活至少1年。移植4.5个月时12.3%±1.8％移植细胞存活，移植细胞呈神经元及星形胶质细胞表型［22］。

    定向分化的神经前体细胞系(RN33B)移植到成年或新生大鼠纹状体内，可观察到移植细胞存活且与宿主组织整合。细胞分化形成神经元或星形胶质细胞，约10％移植细胞表现为纹状体中等大小投射神经元［18］。可见，移植细胞对体内微环境的反应还与细胞分化状态或成熟程度有关，提示将干细胞诱导为定向分化的神经前体细胞后再移植，可能有助于控制损伤环境中移植细胞的分化［23］。

    4  定向分化的前体细胞移植治疗脊髓损伤

    干细胞具有多向分化潜能，同时移植后其进一步分化不易控制。正常CNS中不同移植环境明显地影响移植干细胞的分化。损伤或病变CNS微环境更加复杂，干细胞往往迁离移植部位或分化成星形胶质细胞，而非分化为神经元或少突胶质细胞［16］。将大鼠神经干细胞移植治疗脊髓损伤，干细胞移植8周后主要分化为星形角质细胞或处于未分化状态，未发现少突胶质细胞或神经元分化形成。提示脊髓损伤环境中不利于干细胞向神经元或少突胶质细胞分化［18］。将移植细胞预先分化为前体细胞或直接移植定向分化的神经前体细胞(神经元或少突胶质前体细胞)可能会有助于控制移植细胞分化［24］。有研究报道，人胚胎干细胞诱导分化为少突胶质前体细胞治疗成年大鼠脊髓损伤，结果显示，治疗组脊髓损伤部位内移植细胞存活，分化为少突胶质细胞并形成髓鞘，恢复了一定程度的神经功能。实验未发现星形胶质细胞或神经元分化［24，25］。

    目前，细胞移植策略在治疗脊髓损伤中具有良好的前景，仍是目前脊髓脊髓损伤治疗的研究重点。进一步认识移植微环境对细胞分化的影响，解决移植细胞在损伤部位分化的调控问题，可能对提高细胞移植治疗脊髓损伤的效果有重要意义。

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作者单位：第三军医大学新桥医院骨科, 重庆 400037