球形多孔支架材料体内血管化的量化分析

【摘要】  ［目的］研究球形多孔β磷酸三钙（βTCP）支架植入体内后的血管形成情况。［方法］选择成年新西兰兔30只，随机分为5组，每只兔植入一个球形βTCP材料（直径2 cm，孔径500～600 μm，内连接径110～120 μm），于术后1、2、4、8、12周取材进行组织学观察、定量分析血管长入情况。［结果］术后1周未见新生血管。术后2周，支架外周见细小幼稚的血管。4周时，为血管化的第一个高峰，与2周比血管数量增加（P＜0.05）。8周时，血管数及直径增加，但无统计学意义（P＞0.05）。12周时，为第2次血管化高峰，见粗大成熟的血管，与其他时间比血管直径增大（P＜0.05）。［结论］血管化分阶段进行，即早期数量的增加和后期质量的提高。材料的结构和降解特性影响血管化。

【关键词】  支架材料； βTCP； 血管化； 量化； 组织形态测定术

    Quantification of vascularization within spherical porous βTCP scaffold in vivo∥MA Chao,WANG Zhen,LU Jianxi,et al.Department of Orthopaedics of Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

    Abstract：［Objective］To explore the vascularization within spherical porous βTCP scaffolds in vivo.［Method］Thirty adult rabbits were selected and divided into 5 groups randomly.Spherical porous βTCP scaffolds(the diameter was 2 cm,the  pore size was 500～600μm,the interconnection size was 110～120　μm) were harvested at 1,2,4,8 and 12 weeks after embedded into musclefascia lumbodorsalis pouches in each rabbit separately,in order to observe the vascularization by means of morphological and quantificational analysis.［Result］No vessel was detected  at one week after surgery,and only a few immature vascular buds could be seen at the 2nd week.The first vascularization peak could be observed at 4 weeks,characterized by the growth of quantity of new blood vessels(P＜0.05).At 8 weeks,vasculature reform happened due to relative insufficient supply of oxygen and nutrition,showing the enlargement of new vessels'd iameters.At 12 weeks,the 2nd vascularization peak was shown that the diameter of new vessels increased(P＜0.05)and mature vessels had thick walls and little branches,while the numbers of vessels remained stable(P＞0.05).［Conclusion］The process of vascularization comprises two phases,the quantity increasing in the early stage and the quality enhancing in the later stage.The special architecture and biodegradation characters of scaffolds could influence the vascularization.

    Key words：scaffold;  βTCP;  vascularization;  quantification;  histomorphometry

    迅速而有效的血管化是支架材料内部细胞成活、分化，进而成骨，修复骨缺损的先决条件。因为血管化不足，目前构建的组织工程骨多在5 mm×5 mm×5 mm以内，难以满足修复大段骨缺损的需要［1］。大量研究［2～5］通过优化材料的三维结构来促进血管化，认为多孔材料内部的孔径、内连接径、空隙率与血管的长入有密切的关系，但具体过程还未探明。本实验将一种直径为20 mm的球形多孔支架，不复合细胞或促血管生成因子，植入动物体内，量化分析特定空间结构下的血管化规律，为临床实践提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料与器械

    球形多孔支架材料（上海贝奥路生物材料有限公司），成分为β磷酸三钙（βTCP），纯度>95%，由βTCP粉末,经＞1 100 ℃高温烧结而成。规格为：直径2 cm球体，具有内部连通的三维结构，孔隙率为(70±15)％，孔径500～600 μm,孔型为分布均匀的球形，孔壁光滑，连接径为110～120 μm，孔隙连通率＞99％，力学强度＞2 MPa。Leica 1600硬组织切片机(德国Leica公司)，Leica MTLA专业级显微镜(德国Leica公司)，Pixera Pro600CL冷光源数码摄象头(美国Pixera公司)。

    1.2  实验动物及手术

    成年新西兰白兔30只（由第四军医大学实验动物中心提供），体重2.5～3.0 kg，均为雌性，随机分为５组，每只植入1枚材料。

    按文献报道［2,6］，速眠新I号（军事医学科学院军事兽医研究所）0.2 ml/kg肌肉注射麻醉,常规消毒铺单。取背部正中纵行切口,长约5～6 cm，游离一侧皮下，显露腰背筋膜,保护腰背动脉。在肩胛下角内下方距离正中线约2 cm处纵向切开腰背筋膜,深至肌层表面,切口长约２～3 cm,在腰背筋膜与肌膜之间钝性分离,将球形材料置入其中，缝合切口，止血、清洗伤口后逐层关创。术后常规预防感染。术后1、2、4、8、12周分别取材观察。

    1.3  组织切片及形态学观察

    术后1、2、4、8、12周处死实验兔，取材，10%甲醛(pH=7.2)固定14 d，淋洗、脱水，甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)包埋，置4℃冰箱自然凝固。连续平行切片，取直径为（20±1） mm的切片（过球体中心，即中截面），厚约200 μm。磨片至约50 μm，抛光，Van Gieson′s苦味酸-品红染色，定性观察。

    1.4  组织形态测定

    16倍镜下在随机设定的x、y轴取4个区域，50倍镜下在上述四个区域中随机取4个视野，用Leica MTLA全自动专业研究级显微镜(德国Leica公司) 进行图像采集，得到16张图片。以细长内皮样细胞形成的腔隙结构判断为新生血管。

    测量参数：(1)血管数；(2)血管直径；(3)组织长入深度比例（proportion of tissue penetration,PTP）%=组织长入深度/材料半径(4)血管相对百分比(relative vessel percentage，RVP)%=血管面积/新生组织面积16个视野。最后的数据求均值为此切片的相应参数值。

    1.5  统计学处理

    数据以±s表示，经SPSS 11.0软件处理。各个参数的随时间变化的差异用完全随机设计的单因素方差分析（oneway ANOVA）,时间点之间行多重比较（LSDt检验）。血管参数与组织参数之间的关系用Pearson相关检验分析。P<0.05时差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  大体观察

    切口愈合良好，未见渗出、坏死。4周时球体与周围组织紧密粘连，切开见组织向心性生长，有出血点； 12周时球体边缘变毛糙，体积缩小。

    2.2  形态学观察

    术后1周，材料外周约1个大孔范围内可见大量红细胞渗入，伴少量炎细胞，无新生血管。2周时组织长入约3个大孔的范围，可见单层内皮细胞围成腔隙样的幼稚血管，通过内连接孔穿行（图1a）。4周时，组织向心性长入约6个大孔范围，可见大量的新生血管，穿过多个孔隙，互相沟通成网。材料外周血管较粗，越靠中心越细（图1b）。8周时，组织长入约7～8个大孔范围，细胞增多，以成纤维细胞为主。血管数量变化不大，但血管变粗，管壁圆润，管腔内可见大量红细胞团。材料外周大孔孔壁断裂、崩解，可见吞噬材料颗粒的巨噬细胞（图1c）。12周时，组织长入约8～9个大孔范围，外周孔隙完全被新组织填充。多见粗大成熟的血管，但穿过内连接孔时变细，与内连接孔大小相当（图1d）。

    图1a  2周时开始有血管、纤维组织长入材料外周孔隙(VG×100)  图1b  4周时血管生长旺盛，数量增多，直径变化不大，穿过内连接孔生长(VG×100)  图1c  8周时血管直径变大，其内见大量红细胞；纤维组织生长旺盛，细胞数量增多；材料开始出现降解，孔壁缘有巨噬细胞(↑)(VG×200)  图1d  12周血管粗大，结构成熟(VG×100)2.3  量化分析  测量结果见（表1）

    总的比较，血管数量、直径、PTP及RVP随时间增加，有明显差异（P<0.05）。两两比较，(1)血管数量：1～4周急速增加，4>2>1周（P<0.05）；但4周后进入平台期，与8、12周间无统计学差异（P>0.05）（图2a）。(2)血管直径：8周之前约60～80 μm，保持恒定，各时间点间无差异（P>0.05）；12周时增大＞100 μm，最大可达227.80 μm，与其他时间点有明显差异（P<0.05）（图2b）。(3)PTP：随时间不断增加，各时间点之间有统计学差异（P<0.05）（图2c）。(4)RVP：4周>2周>1周（P<0.05），8周时下降（P<0.05），随后又上升，但与12周之间无差异（P>0.05）（图2d）。表1  各时间点血管与组织参数测量值注:※1周无血管形成，故除“PTP”外，其他参数不参与方差分析，以保持方差齐性

    图2a  血管数-时间变化图  图2b  血管直径-时间变化图  图2c  PTP-时间变化图  图2d  RVP-时间变化图

    相关分析，血管数量、直径与PTP相关系数(r)分别为：0.964  0.854（P<0.05）；血管数量与RVP相关系数r=0.545（P<0.05）；但血管直径与RVP关系不大r=0.099（P>0.05）。

    3  讨  论

    有效血管化是组织工程骨的成活、新骨形成的关键因素。良好的血液供应不仅能提供新生组织赖以生存的营养和氧气，而且对于提高骨细胞的活性和迁移能力，最终促进骨的塑形有重要意义［7］。

    本实验采用一种具有可控内部结构的球形支架材料，不同以往研究2～5］。球体具有形状规则、各向同性（isotropy）的特点，新生血管向心性长入的速度及程度受材料几何外形的影响不大，且可做任意方向的截面进行观察。球体能获得最大的材料-组织接触界面，利于血管长入。

    术后1周无血管形成，因为在一个大孔的范围内，细胞可以靠渗透作用获得营养供应。随着组织长入更深，细胞数目增多，对氧气、营养的需求增加，术后2周开始有血管形成；4周时达到血管化高峰，血管数量急剧增多，但血管细小，是数量的优势保证了充足的血供。新生组织逐渐成熟、细胞增加，故相对而言；8周时RVP反而下降，随后在现有血管基础上开始增粗塑形；至12周时，可见许多成熟的粗大血管，出现以血管质量的提高为特征的血管化高峰。

    相关分析发现血管数量、直径与PTP密切相关，说明血管化要适应组织生长的需求，这一机制贯穿血管化的始终。PTP是组织长入情况，血管数与PTP的相关系数比血管直径更大；RVP代表了血管供血的能力，血管数与RVP相关，而血管直径与之无关，这都说明血管数量是血管化的重要方面，在促进组织长入中的作用更大。在构建组织工程骨时，应寻找更利于血管数量增加的支架材料。

    支架材料具有的三维空间结构、生物可降解性、几何外形等特性是血管化的保证。文献报道［8］，孔径达100 μm才能满足细胞迁移和转运的需要，而大于300 μm时可以促进新骨和毛细血管的形成。本实验中所用的材料孔径为500 μm，内连接径为110～120 μm，便于细胞进入孔隙中。大量内皮前体细胞分化为内皮细胞，形成早期的血管丛，故表现为数量的急剧增加。材料适宜的降解速度可保证孔径、内连接径变大，适应后期血管增粗。12周时球体周边的孔隙结构崩解为无定形状态，常见粗大的血管。Lu等［9］则认为在可吸收材料中，孔隙率的重要性比孔径要大，因为孔径可随材料的降解而变化。支架的几何外形对血管化乃至成骨也有一定影响。Jin QM等［3］比较块状、颗粒状与蜂窝状支架的成骨情况，发现前2种形状支架有助于提高血管化，促进直接骨形成，球体材料因具有特殊外形，表面积大，利于血管长入。

    综上所述，支架材料内的血管化是分阶段进行的，即包括早期血管数量的增加和后期血管质量的提高，具有适宜外形、内部结构的生物可降解支架材料利于血管长入。本实验进行了球形材料中血管化的观察分析，而球形与其他形状材料的比较有待进一步研究。

【参考文献】
  ［1］ 吴永超.组织工程骨血管化的研究进展［J］.国外医学生物医学工程分册,2003,3:125-128.

［2］ 白 峰，王 臻，李爱民,等.2种不同三维结构βTCP材料体内血管化的比较研究［J］.中国矫形外科杂志，2007，6:451-454.

［3］ Jin QM,Takita H,Kohgo T, et al.Effects of geometry of hydroxyapatite as a cell substratum in BMPinduced ectopic bone formation［J］.J Biomed Mater Res,2000,3:491-499.

［4］ Henno S,Lambotte JC, Glez D,et al.Characterisation and quantification of angiogenesis in βtricalcium phosphate implants by immunohistochemistry and transmission electron microscopy［J］.Biomaterials,2003,19:3173-3181.

［5］ Hing KA,Best SM,Tanner KE, et al.Quantification of bone ingrowth within bonederived porous hydroxyapatite implants of varying density［J］.J Mater Sci Mater Med,1999,10:663-670.

［6］ 胡学峰,洪建明,王 臻,等.一种生物陶瓷体内血管化动物模型的建立［J］.中华实验外科杂志,2006,1:98-100.

［7］ Barou O,Mekraldi S, Vico L,et al.Relationships between trabecular bone remodeling and bone vascularization: a quantitative study［J］.Bone,2002,4:604-612.

［8］ Karageorgiou V,Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis［J］.Biomaterials,2005,27: 5474-5491.

［9］ LU JX,Flautre B,Anselme K,et al.Role of interconnections in porous bioceramics on bone recolonization in vitro and in vivo［J］.J Mater Sci Mater Med,1999,10：111-120.

作者单位：1.第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安 710032;2.上海贝奥路生物材料有限公司,上海 200018