蚕丝带韧带支架材料研究进展

【关键词】  韧带

  1  韧带损伤概述

    关节是一个复杂的力学系统，接受、传递和分散骨与骨之间的载荷。韧带在这个系统中起到韧性连接的作用，维持关节稳定和协调关节运动，是最重要的稳定器。韧带还是各种营养成分的传输媒介和蓄积场所，也是抵抗外界蛋白，包括抗原、病毒和细菌的机械屏障。韧带中的纤维主要是Ⅰ型胶原(90％)以及少量的Ⅲ型胶原，也有网状纤维和弹性纤维。

    在日常生活中，韧带出现损伤的概率相当高，其后果则是伤后立即导致关节的不稳定以及远期导致其他组织的退化［1］。尤其在骨性关节炎病人中，韧带损伤已经被证实是重要的早期诱因之一［2］。但韧带的自我修复能力很差，损伤后的韧带必须通过手术置换以恢复其功能。

    2  韧带修复材料发展

    自20世纪80年代起，治疗韧带损伤的置换物主要包括2大类：(1)自体移植物，但自体移植物存在着供区炎症以及移植物萎缩等问题；(2)其后开发的人工韧带，但其在临床应用中存在材料与骨表面磨损以及应力疲劳等问题因而未能取得良好的效果。近年来，组织工程技术的发展显示出其在韧带修复重建中的巨大潜力。运用组织工程的方法，以支架材料为载体，整合分离种子细胞，在体外预先构建有生命的种植体，植入体内以修复组织缺损，替代后重建器官结构维持改善组织器官功能。这种组织工程支架必须利于组织生长、营养物质的供应和新血管的生成，并且在体内被吸收，最终生成新的组织。组织工程韧带支架诱导韧带细胞在其上的生长、增殖和分化，并为细胞提供三维代谢环境和力学支撑，因此对其使用的支架材料有特殊要求：(1)支架材料不仅能够完全降解，并且降解时间要求同韧带恢复的周期相匹配；(2)材料具有同天然韧带相似的力学性能和物理形态；(3)具有良好的生物相容性，材料无细胞毒性、无抗原性，植入体内后降解产物不会引起炎症反应；(4)具有良好的细胞亲和力，促进细胞的生长分化［3］。

    迄今为止，用于韧带损伤修复研究中的支架材料大致可分为合成可降解材料和天然生物材料两种。合成可降解材料一般细胞亲和力较差，相比天然生物材料，合成材料诱导细胞在其表面的黏附、生长及分化的能力较弱。天然生物材料主要包括胶原和蚕丝两大类。其中胶原的优点包括：(1)来源广泛，容易从活体组织中分离纯化，因此价格相对便宜并且供应稳定；(2)容易被机体吸收并且具有很低的抗原性；(3)优良的机械性能，天然的胶原纤维具有较好的强度和黏弹性［4］。但其缺点也同样突出，因为胶原支架材料主要是从动物组织中获得，而不同种属胶原之间存在着结构和氨基酸序列的差异，因此其免疫原性倍受关注。虽然胶原的临床反应很少，但仍有一些过敏反应被报道［5］，其长期的副作用更不为人知。

    3  蚕丝韧带

    相比较之下，蚕丝则具备更多的优点。蚕丝主要由丝素和丝胶组成，每根蚕丝由2根平行单丝靠丝胶黏合而成。单丝中间为丝素纤维，外围为丝胶。丝素是一种纤维状蛋白质，主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，难溶于水。丝胶则是一种球状蛋白质，易溶于水。由于具备优良的机械性能，蚕丝很久以前就被用做手术缝合线材料，过去由于丝素提纯方法不足，缝线中的残余丝胶经常导致一些生物相容性问题。近年来，随着丝素提纯方法的进步，丝胶几乎完全去除，制得的丝素抗原反应极小，蚕丝在医学领域得到更广泛应用。

    3.1  降解速度

    在韧带重建中，许多支架材料降解太快以至于不能维持足够的时间形成新组织。而蚕丝降解速度较低，在体外实验中一年内失去大部分的抗张强度，在体内2年后植入位点已经不产生异体识别，意味着蚕丝的全部降解［6］。另外，丝素在体内被缓慢地吸收，吸收的速率与移植点、机械环境、病体的健康和生理特点、种类及丝素纤维直径有关，并且蚕丝处理过程可能导致蛋白质结构的变化，使丝素的降解速度发生改变［7，8］。

    3.2  机械性能

    对蚕丝力学特性上进行研究探明了它的强度和弹性系数，与生物体的肌腱有着近似的数值。考虑到传统的脱胶方法对蚕丝结构产生破坏，降低了蚕丝的力学特性，新加坡的学者使用去甲二氢愈创木脂酸(NDGA)作为交联剂将明胶交联在丝素纤维上替代原有的丝胶，使脱胶后的丝素纤维仍然保持与天然蚕丝类似的结构，其力学特性及膨胀性较丝素纤维有明显提高［9］。同时，机体内正常组织细胞功能的发挥与细胞之间的三维空间结构关系是密不可分的，因此设计能够提供细胞生长的三维空间的支架材料是目前组织工程研究领域的重点之一。丝素蛋白溶液能被加工成泡沫、薄膜、纤维和网状结构等多种形式。根据组织工程基质的要求，丝素可以制备成薄膜、纤维或海绵等形状。如果再通过化学修饰的方法在支架上结合所需的各种组织因子，则能够促进组织生长，形成与具体组织的功能要求相匹配的，能够在体内缓慢降解的组织工程材料。目前研究的无论是体外的各种细胞反应容器还是动物实验，种子细胞都经由支架材料表面通过分裂扩增向其内部生长。未经生长因子修饰的三维组织工程材料虽然具备了三维的立体空间结构，但由于内部空间相比于支架外部养分缺乏、代谢产物浓度高等原因，种子细胞更愿意向外部生长，而通过普通修饰带有生长因子的支架材料内部的细胞则更多，但是呈现由外到内细胞数量逐步递减的现象，这可能与普通修饰的细胞因子在液体环境中容易脱离支架母体向浓度更低的地方扩散有关。目前较好的解决方法是改良组织因子修饰技术，使其固定在支架内部缓慢释放，这样支架内部细胞的生长就会有更好的均一性。由此可见，蚕丝是可望用于作为人工肌腱与韧带的理想材料。   

    3.3  生物相容性

    Inouye等的研究比较了使用丝素蛋白涂层、胶原涂层以及亲水基团涂层3种不同的培养皿上细胞生长情况，发现在丝素蛋白和胶原涂层培养皿上锚定的细胞数量几乎相当，但是比用亲水基团涂层的聚苯乙烯培养皿上的细胞数量要多出30％～50％［11］。Meinel等研究了丝素膜在体内和体外的炎症反应。在体外研究中，丝素膜上的细胞增殖速率要比在胶原和TCP(tissuecultureplastic)上高;在体内实验中，胶原膜的炎症反应较丝素膜明显，而PLA膜炎症反应最为明显［12］。以上研究证实了丝素蛋白具有良好的生物相容性，是一种很好的细胞培养基质。

    3.4  细胞亲和力

    Uager等研究了在体外实验中非纺织丝素纤维网上人类内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞和成骨细胞的黏附和生长，发现所有细胞都容易在丝素纤维网上黏附和增殖［13］。另外Sofia等进行了丝素膜上骨组织生长情况的研究，他们将膜表面用骨形态发生蛋白(RGD)进行化学修饰，然后在体外诱导骨组织生长，发现修饰后的丝素膜上骨形成显著提高［14］。此项研究表明丝素蛋白与骨组织亦具有良好的生物相容性，用RGD修饰过的丝素能促进骨的形成，为韧带重建术后，韧带支架与骨隧道之间能够实现良好的“腱”-骨愈合提供了实验依据。吴海涛等采用聚乳酸与蚕丝的复合二维支架进行兔软骨细胞的培养。在蚕丝三维支架上滴加软骨细胞悬液后，软骨细胞在不规则轻微漂动和缓慢下沉过程中粘附在蚕丝上，1～2 d后完全贴壁；培养3 d后软骨细胞开始分裂，5 d后，细胞生长增殖十分活跃；2周时，蚕丝三维支架网眼充满软骨细胞，生长在蚕丝支架上的软骨细胞分泌大量蜘蛛网样基质［15］。

    基于以上的研究结果，Ahman等开发了一种蚕丝丝素纤维基质制作这种丝素纤维基质。首先选用30根平行丝素纤维合成一束，6束这种丝素束扭合成一股，3股扭合成一索，6束平行合成ACL基质。这种6索的丝素基质与人自身ACL的机械特性很相似，可以成功地满足人类ACL的力学特性且有良好的抗疲劳能力。通过扫描电镜观察，DNA测定，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达以及黏胶蛋白C标记，证实了丝素基质能够支持成人骨髓基质细胞黏附、扩增和分化［16］。

    但是Ahman设计的蚕丝韧带支架也存在不足，其韧带支架由540条丝素纤维紧密螺旋编织而成，虽然由于丝素纤维的良好生物相容性和细胞亲和力，种子细胞在韧带支架表面贴附增殖良好，但其内部的致密结构使得细胞向内生长十分困难，不利于形成三维立体的细胞网络，因此在蚕丝韧带强度逐渐消退的同时，  自体韧带的形成速度及强度能否得到保证有待于进一步研究。

    4  结  语

    总而言之，由于良好的机械性能、生物相容性、细胞亲和力和长期的生物可降解性，丝素材料可以很好的克服现有支架材料的局限性，成为组织工程韧带修复重建理想的支架材料之一。

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作者单位：(南京医科大学鼓楼临床医学院关节外科， 江苏省南京市中山路321号 210008)