自体成骨细胞培养移植治疗骨折延迟愈合／不愈合11例初步观察报告

【关键词】  骨折

    骨折延迟愈合、不愈合是创伤骨科的一大棘手并发症。近年有大量关于从骨髓间充质干细胞分化培养成骨细胞的成功研究报道。于是作者设计开展了自体骨髓成骨细胞培养、移植治疗骨折延迟愈合、不愈合的临床研究，本文将作者初步研究结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  病例资料

    2006年4月～2007年7月，作者共收治11例病人，病例入选标准：骨折后4个月，经X线片证实骨折端无明显骨痂生长，诊断骨折延迟愈合，并极有可能发展成骨折不愈合的病例；骨折后6个月，经X线片证实骨折端无骨痂生长，诊断骨折不愈合。本组中男7例，女4例，骨折延迟愈合8例，骨折不愈合3例；胫骨4例，股骨7例；年龄最小19岁，最大61岁，平均36.1岁。车祸9例，高处坠落伤2例。

    1.2  主要试剂

    DMEMF12培养基、胎牛血清（Hyclone公司），4℃保存。胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司），人淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程医学研究所）,β甘油磷酸钠（Sigma公司），地塞米松（上海通用药业公司），维生素C（上海禾丰制药公司），20％人血白蛋白（上海生物制品研究所）。

    1.3  技术方法

    1％利多卡因局麻下，以骨髓活检针于患者自体髂骨髂前上嵴穿刺，用含有l ml肝素钠的10 ml注射器抽取红骨髓10 ml。将骨髓注入50 ml离心管中，加10 ml生理盐水稀释，再将其加入含有15 ml淋巴细胞分离液的离心管中，以2 500  r／min进行离心20 min。离心后用毛细吸管吸取中间云雾状的细胞层，生理盐水洗涤两次，收集细胞，加入到含有15％胎牛血清的DMEMF12培养液中，在37℃、95％相对湿度、5％CO2的培养箱中培养。4 d后换液，加入地塞米松1×10-8 mol/L、β-甘油磷酸钠1×10-3 mol/L、和维生素C 1×104 mol/L，继续培养，等到细胞长满整个培养瓶后，用0.25％胰蛋白酶消化，进行分瓶在条件培养基中传代培养。大约在21 d左右，细胞长满整个培养瓶时，开始收集细胞。将成骨细胞收集悬浮于20％1 ml人血白蛋白中，细胞数大约5×106个／部位，先消毒、以注射器针头在X线透视定位下，将成骨细胞准确注射移植入骨折断端，定期复查X线片，根据骨折端骨痂生长情况，追踪了解骨折愈合进度。

    1.4  结  果

    11例病人均得到随访，随访时间8～19个月。4例治愈，平均愈合时间为成骨细胞移植后6.8个月;5例有效，有效率90.9％，均在成骨细胞植入1个月后定期复查，发现逐渐有骨痂生长，骨折线逐渐模糊；1例无效，该患者为开放性、粉碎性股骨骨折，行外支架固定4个月后骨折不愈合，行自体成骨细胞培养移植观察3个月，仍无效后再次行植骨术。无1例出现注射部位红肿、热痛等感染现象。

    典型病例，患者，男，29岁。诊断：左股骨中下段骨折、左胫腓骨骨折。于2006年5月行骨折切开复位、内固定术，手术后6个月骨折不愈合。2006年12月行自体骨髓成骨细胞培养、移植。骨折于移植后7个月愈合。

    2  讨  论

    骨折延迟愈合是指超过骨折愈合时间，而骨折尚未愈合，时间通常为4个月。如果不予干预，骨折延迟愈合发展成骨折不愈合的可能性非常大。为了防止骨折不愈合的发生，故本研究将有可能发展成骨折不愈合的延迟愈合病例也纳入本研究组中。

    将成骨细胞悬浮于20％人血白蛋白中，主要是考虑白蛋白粘性较好，用小针注入骨折断端后，避免流动较远，利用白蛋白的良好粘性，黏附于断端及附近的骨、骨膜、纤维上。注射前在透视下要准确体表定位，注射时针头刺入断端，有一定手感，再次透视确保穿刺准确。要避免多次穿刺造成人为“窦道”，防止细胞流失。

    本组11例中，均有效，4例治愈，说明本研究方法可行、有效。但骨痂生长较慢，没有预期的生长快，可能和骨折端周围血运差、断端纤维肉芽较多、病人活动少等原因有关。

    近年来陆续有较多文献报道将成人骨髓基质细胞体外诱导培养成骨细胞的实验方法，尽管报道实验方法的文章有很多，但都大同小异，基本方法一致［1～4］。在所有的理化因素中，地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素C是最重要的。地塞米松可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞方向转化，对成骨细胞的增殖与分化有明显的促进作用；维生素C为胶原合成所必须，还可调节ATP酶与ALP活性及非胶原基质蛋白的合成；甘油磷酸钠为成骨细胞功能活动提供磷离子［3～4］。目前通过体外诱导培养，培养出具有成骨能力的成骨细胞的可靠性已经为大家所公认。

    图1  成骨细胞原代培养第4 d  图2  成骨细胞传代培养第4 d  图3  注射移植时的透视定位  图4  移植前的X线片（内固定术后6个月）

    图5  移植后第2个月X线片  图6  移植后第5个月X线片  图7  移植12个月后拆除内固定的X线片 

    图8  拆除内固定后1个月

    本研究的骨髓取自自体，去除了因免疫因素引起排异反应的可能。本方法简便易行、操作简单、微创，具有较高的成功率，一旦成功，可以使患者免除重新植骨、内固定手术的创伤，免除沉重的身体、经济负担。因此，本方法是对治疗骨折不愈合、防止骨折延迟愈合发展成骨折不愈合的一种全新、有效方法，但仍需继续深入研究。

【参考文献】
  ［1］ 任高宏，裴国献，王 钢,等．成人骨髓成骨细胞体外培养［J］．骨与关节损伤杂志，2003，2：118-121.［2］ 杨 林，陶天遵，刘忠厚．人骨髓基质细胞培养及向成骨细胞的诱导分化［J］．中国骨质疏松杂志，2007，4：253-254.

［3］ 黄 艳，李莹辉．影响骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素［J］．中国生物工程杂志，2006，5：85-88.

［4］ Yamamoto N，Isobe M，Negishi A，et al．Effects of autologous serum on osteoblastic differentiation in human bone marrow cells［J］.J Med Dent Sci，2003,1：63-69．

作者单位：广东省中山市人民医院骨科, 528403