溶血磷脂酸对嗅鞘细胞形态增殖及表达脑源性神经营养因子的影响

【摘要】  观察溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)对体外培养的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)形态、增殖和表达脑源性神经营养因子(brainderived neurotropic factor，BDNF)的影响。［方法］取成年大鼠原代OECs经纯化后培养，分别用1、5、10、20、50 μm／L的LPA干预一定时间后，用免疫荧光染色法、MTT、Western Blot技术分别观察OECs形态变化、增殖和表达BDNF的情况。 ［结果］LPA使OECs形态由突起形向扁平形转变，去除LPA可逆转这种转变；1～50 μm／L的LPA均能促进其增殖，干预后60 h达到增殖高峰，浓度为10 μm／L时促增殖作用最显著;1～50 μm／L的LPA均可上调其表达BDNF。［结论］LPA能使OECs形态由突起形向扁平形发生可逆性变化；能促进OECs增殖并具有时间和浓度依赖性；能上调OECs表达BDNF。

【关键词】  溶血磷脂酸 嗅鞘细胞

   Effects of lysophosphatidic acid on    morphology proliferation and brainderived neurotropic factor expression of olfactory ensheathing cells∥ZHU Zhonggeng, WU Xiaotao, GUAN Xueneng, et al. Department of Orthopaedics, Central Hospital of Shanghai Songjiang District, Shanghai 201600, China

    Abstract：［Objective］To investigate the effects of lysophosphatidic acid (LPA) on the morphology, proliferation and brainderived neurotropic factor (BDNF) expression of olfactory ensheathing cells (OECs) in vitro.［Method］Primary cultures of OECs separated from adult rat olfactory bulbs were purified and cultured. Five experimental cultures were grown for a period of time in media with LPA at different concentrations, namely 1, 5, 10, 20 and 50 μmol/L, and the control culture was grown in the medium without LPA. Immunofluorescent staining was used to identify OECs and to  observe their morphological changes. The proliferation of OECs was measured by MTT assay. Western blotting was used to detect the protein expression of BDNF.［Result］Exposure to LPA in medium induced the switch in the dominant morphology of OECs from processbearing to flat morphology. This shift in morphology was reversed when LPA was  removed from media. LPA at concentrations from 1 μmol/L to 50 μmol/L enhanced OECs proliferation,  especially at the concentration of 10 μm/L. Proliferation of OECs in all experimental cultures reached their respective significant peaks after 60 h of LPA treatment. There were significant upregulations in BDNF expression of OECs treated with LPA (1～50 μm/L) compared with those in the control culture.［Conclusion］A reversible change from process-bearing to flat in morphology of OECs can be induced by LPA. LPA stimulates OECs proliferation in a time and concentrationdependent manner. LPA upregulates BDNF expression of OECs.

    Key words：lysophosphatidic acid;  olfactory ensheathing cells;  morphology;  proliferation;  brain-derived neurotropic factor

    尽管OECs用于中枢神经损伤修复研究己近20年，并被普遍认为是最有应用前景的候选细胞［1］，然而对其某些基本的生物学特性如免疫学与形态学关系的认识仍然存在分歧［2，3］。此外，OECs神经修复作用受到其表达特性的影响，特别是某些神经营养因子如脑源性神经营养因子(brainderived neurotropic factor，BDNF)的表达［4］；OECs在体外增殖速度很慢，须用增殖剂扩增以后才能满足研究需要。如何促进其增殖又能维持其良好的神经再生特性仍是研究热点。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是磷脂中最简单、最小的分子，通过结合细胞表面G蛋白偶联受体，随后激活G蛋白异源三聚体链接的下游事件发挥各种效应，具有改变细胞形态、刺激细胞增殖、促进胞内钙动员激活多种信号级联反应等生物学作用［5］。目前关于LPA对OECs的影响，文献鲜有报道。本实验以LPA为干预因素，利用OECs免疫性标志物p75为纯化手段，观察OECs在细胞形态、增殖及表达BDNF的变化，进一步探讨其生物学特性，并为OECs修复中枢神经损伤的研究提供帮助。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    成年雌性SD大鼠(200～250 g，东南大学医学院实验动物中心)；DMEM／F12培养基、N2培养基(美国GIBCO公司)；溶血磷脂酸、MTT试剂盒(美国SIGMA公司)；兔抗低亲合性神经生长因子受体(p75)抗体、兔抗BDNF、抗βactin抗体(美国SANTACRUZ公司)；偶联异硫氰酸荧光素羊抗兔IgG、偶联辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(武汉博士德生物技术公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  OECs的原代培养  取成年SD大鼠嗅球，剪碎、消化后通过65 μm的细胞滤器制成单细胞悬液，用D／F10 S制成密度为6×105／ml的细胞悬液并接种在左旋多聚赖氨酸包被的25 cm2细胞培养瓶中，置于37℃、体积分数5％的CO2的环境中维持培养：培养至第3 d每个培养瓶中加入1 mlD／F10 S，2 d后全量换液，再过2 d进行纯化。

    1.2.2  OECs的纯化  按文献［6］的方法进行纯化：用1.25 g／L胰蛋白酶和0.2 g／LEDTA将上述细胞消化成细胞悬液，800 r／min离心并用D／F10 S洗涤。再次离心5 min后，细胞沉淀物用D／F10 S重新制成密度为6×105／ml的细胞悬液，然后接种到未经任何包被处理的培养瓶中，在37℃、体积分数5％的CO2条件下孵育1 h后，将仍然悬浮的细胞接种到包被p75抗体的培养瓶中继续孵育。孵育45 min后，用DMEM／F-12洗涤5遍以清除未贴壁的细胞。贴壁细胞即为纯化的OECs。用吸管小心地吸净培养瓶内的培养液，取出预先放置在培养瓶内的玻片作纯度鉴定，瓶内细胞用刮刀收获并用D／F-10S制成细胞悬液备用。

    1.2.3  OECs的鉴定  利用OECs的特异性标志物p75作细胞免疫荧光染色进行鉴定。用40 g／L的多聚甲醛固定30  min，0.01 mol／L的PBS冲洗3次，加50 g/L的牛血清白蛋白封闭液封闭60 min后，加入兔抗p75抗体(1∶200)4℃孵育过夜，0.01 mol／L的PBS冲洗3次，加入FITC标记的由羊抗兔IgG(1∶200)37℃孵育1 h，0.01 mol／L的PBS冲洗3次。对照实验将一抗用0.01 mol／L的PBS代替，其余步骤同上，结果为阴性。对p75呈阳性反应的细胞鉴定为OECs。OECs纯度通过随机选取200倍视野，分别于明场下计数细胞总数及荧光视野下计数阳性细胞数，并计算出二者阳性细胞的平均比例。

    1.2.4  LPA的稀释和实验分组  LPA的稀释按照文献［7］的方法进行。下列操作均按照培养液中LPA的浓度的不同分为5个实验组：1 μm／L、5 μm／L、10 μm／L、20 μm／L、50 μm／L组。对照组培养液中加入含10 g/L无脂肪酸牛血清白蛋白的PBS。

    1.2.5  细胞免疫荧光染色观察LPA对OECs形态的影响  纯化的OECs以1×104／ml的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的内置玻片的6孔培养板中，培养48 h后，弃去培养液，用DMEM／F12洗涤3次，更换为N2培养基，培养24 h后再加入各浓度的LPA(对照组仅加入含10 g/L无脂肪酸牛血清白蛋白的PBS)继续培养，24 h后弃去培养液，再次更换为N2培养基继续培养24 h。各组均于每次更换培养条件前及培养结束时随机抽取细胞爬片经细胞免疫荧光染色后观察细胞形态变化，并计算扁平形细胞比例，每组每次均随机选择6个200倍视野进行计数。OECs形态判定标准：OECs形态可分为扁平形和突起形2种，细胞核周围胞浆范围较大且突起少于2个或突起长度小于胞体宽度的为扁平形细胞，胞浆很少，有2个或2个以上突起且突起长度大于胞体宽度的为突起形细胞。

    1.2.6  MTT检测LPA干预后OECs的增殖活力  纯化的OECs以1×104／ml的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的96孔培养板中，每孔100 μl，培养48 h后，弃去培养液，用DMEM／F-12洗涤3次，更换为N2培养基，继续培养 24 h。再用各浓度的LPA干预，每组24孔。分别在LPA干预后12、24、36、48、60、72、84、96 h，每组取3孔各加入10 μl的MTT，作用浓度为5　g／L，继续培养4 h后，弃上清，每孔加入100 μl的DMSO，待蓝色结晶溶解后用酶链免疫检测仪测定OD值(检测波长为490 nm)，绘制细胞生长曲线，对照组亦按相同方式处理。

    1.2.7  WesternBlot检测LPA干预后OECs表达BNDF的情况   纯化的OECs以1×104／ml的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的25 cm2细胞培养瓶中，培养48 h后，弃去培养液，用DMEM／F12洗涤3次，更换为N2培养基，继续培养24 h。再用各浓度的LPA干预60 h后，吸去上清液，冰冷的PBS漂洗2次，用100 μl改良的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝比色法进行蛋白定量。蛋白上样量为50 μg，进行120 g／L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜转膜，50 g／L脱脂奶粉非特异性封闭。加入第一抗体，兔抗BDNF抗体(1∶1000)，4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(1∶2000)室温下孵育1 h。加入ECL发光剂1 min，曝光、显影、定影。βactin为内参。图像扫描仪扫描，定量软件分析系统测定每一样本条带的光密度值，目的条带与内对照βactin条带光密度值的比值为该样本中蛋白的相对含量。

    1.2.8  统计学处理  采用SPSS 11.5统计学软件进行分析，数据以(±s)表示，做样本均数t检验或者单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  细胞免疫荧光染色结果表1  不同培养条件下，各组扁平形OECs所占比例的比较情况 与对照组比较：*P<0.01,P>0.05;各实验组之间比较：#P>0.05

    结果显示，纯化后OECs的纯度达(98.5±1.6)％。OECs在D／F10 S中培养48 h后，各实验组扁平形OECs比例占(51.2±8.3)％～(56.3±5.4)％，与对照组比较及各实验组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。当用不含血清的N2培养基替换D／F10 S培养24 h后，各实验组扁平形OECs减少至(21.5±4.8)％～(23.8±1.2)％，与对照组比较及各实验组之间比较差异亦无统计学意义(P>0.05)，此时OECs形态主要为突起形。当加入LPA干预24 h后，各实验组主要细胞形态由突起形向扁平形转变，扁平形OECs增加至(75.3±4.6)％～(78.3±5.6)％，与对照组(22.3±4.0)％比较差异有统计学意义(P<0.01)，但各实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。再用不含血清的N2培养基替换含LPA的培养基培养24 h，各实验组主要细胞形态则返回为突起形，扁平形细胞减少至(21.7±2.6)％～(23.7±3.9)％，与对照组(22.9±3.2％)比较差异无统计学意义(P>0.05)，各实验组之间差异亦无统计学意义(P>0.05)（表1、图1～5）。

    2.2  MTT检测结果

    结果显示，LPA促进OECs增殖呈现时间和浓度依赖性：干预后12 h各实验组与对照组OD值比较差异无统计学意义(P>0.05);10 μm／L组发挥促增殖作用最快，干预后24 h即高于对照组(P<0.01);36～96 h各浓度LPA均能显著促进增殖，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；各实验组均在LPA干预后60 h达到增殖高峰，与之前时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)，之后进入平台期，而对照组各时间点的OD值差异无统计学意义(P>0.05)；干预后12 h 10 μm／L组OD值与其他实验组比较差异无统计学意义(P>0.05)，干预后24 h高于1、50 μm／L组(P<0.05)，36～96 h均高于其他实验组(P<0.05)。见表2。

    2.3  Western Blot检测结果

    结果显示，LPA干预后60 h各实验组BDNF的表达量均高于对照组(P<0.01)，1、5、10、20　μm／L组BDNF表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而50 μm／L组BDNF表达量低于其他实验组(P<0.05)。见图5。

    图1  在含有血清的培养基（D/F10 S）中培养48 h后，扁平形OECs略多于突起形OECs，比例占51.2%～56.3%免疫荧光染色×200  图2  当培养基更换为不含血清的N2培养基培养24 h后，OECs形态主要为突起形，且突起更加细长，扁平形OECs仅占19.9%～23.8%免疫荧光染色×200  图3  当加入LPA干预24 h后，OECs主要形态转变为扁平形，扁平形OECs比例高达75.3%～78.3%免疫荧光染色×200  图4  当再用N2培养基替换含LPA的培养基培养24 h后，OECs主要形态则返回为突起形，扁平形OECs减少至21.7%～23.7%免疫荧光染色×200  图5  不同浓度的LPA对OECs表达BDNF的影响

    3  讨  论

    体外培养的成年大鼠嗅球OECs一般呈现出三种不同形态：双极形、多极形和扁平形。双极和多极形的OECs都有长而细的突起，常被统称为突起形细胞。Franceschini等［3］认为突起形细胞和扁平形细胞属于不同的亚型。突起形细胞对p75呈免疫阳性反应，而扁平形细胞对p75无免疫反应性。但Vincent等［2］认为二者属于同一类型，只是由于形态的可塑性才表现出不同的形态，实际上可以在两者之间相互转换。本研究表明，LPA能促使OECs由突起形向扁平形转变，去除LPA可逆转这种转变，免疫荧光染色显示两种形态的OECs均表达p75，与Vincent等的结论相同。LPA促使OECs形态向扁平形转变可能与Rho信号转导途径有关。LPA能通过G12／13激活Rho途径依赖的细胞骨架重组反应引起细胞变园、神经轴突回缩等细胞形态改变［8］。作者注意到，扁平形OECs数量在含有血清的培养基(即D／F10 S)中明显多于无血清的培养基(即N2培养基)，这可能是由于正常血清中含有LPA的缘故。表2  LPA干预后各实验组与对照组OD值比较情况与对照组比较：*P<0.01,与其他实验组比较：#P<0.05;与本组12 h～48 h比较：P<0.05

    LPA促细胞增殖的机制主要是通过Gi/o蛋白激活Ras下游的丝裂原活化蛋白激酶，引起 细胞增殖。LPA发挥促增殖作用的浓度较广，从0.01 μm／L［9］到50 μm／L［10］的LPA都具有促进细胞增殖的作用。Yan等［11］只是研究了0～5 μm／L的LPA对OECs的促增殖作用，发现LPA发挥促增殖作用的最低浓度为0.1 μm／L，1 μm／L时作用最大。本实验观察到，1～50μm／L的LPA均能促进增殖，浓度低于10　μm／L时促增殖作用随浓度升高呈递增趋势，而高于此浓度促增殖作用随浓度升高呈下降趋势。这种浓度依赖性可能与LPA受体有关。与细胞增殖有关的LPA受体主要有3种，分别为LPA 1～3受体，这些受体广泛分布在OECs及多种类型的细胞中。LPA1、LPA2为高亲合力受体。LPA3为低亲合力受体。LPA与受体结合时，首先与LPA1、LPA2结合，当其结合位点被占据后才与LPA3结合。尽管这3种受体都能激活MAPK，但它们的作用并非一致［12］。当LPA与LPA1、LPA2结合时，则表现出促增殖抗凋亡作用，而与LPA3结合时，则传递促凋亡信号［13］。因此，当LPA达到一定浓度后，LPA将与LPA3受体结合，细胞增殖受到抑制。

    OECs能表达并分泌BDNF。LPA可能通过下述机制上调OECs表达BDNF：通过Gq  蛋白偶联受体激活磷脂酶C，经磷酸肌醇循环，促进细胞内钙动员，随后钙通道孔径发生改变，  又使细胞外钙离子内流，引起胞内钙水平上升［14］，进而激活BDNF基因启动子PⅠ、PⅢ［15，16］。本实验观察到，1～50 μm／L的LPA较对照组均显著上调了BDNF的表达，但当浓度升  高到50 μm／L时BDNF的表达较其他浓度明显下降。BDNF表达下降的原因可能与细胞内钙  离子水平过高引起钙超载有关。研究表明，LPA的促钙离子内流作用具有浓度依赖性，超过一定剂量可引起细胞内钙超载［17］。另外，BDNF本身也可导致细胞内钙离子水平升高，甚至可以达到诱发细胞去极化的水平［18］。由于OECs本身也存在BDNF的受体，因此OECs可受到自分泌BDNF的影响而发生钙超载。钙超载发生后则引起细胞一系列的功能障碍，最终导致OECs表达BDNF下降。

    值得注意的是，虽然LPA可通过Gi/o蛋白偶联受体途径促进OECs增殖，但近来研究表明BDNF还具有刺激OECs增殖的效应［19］，因此不能排除OECs通过自分泌BDNF的方式增强了LPA的促增殖作用。

    本研究在体外证实了LPA能上调OECs表达BDNF，但将LPA干预后的OECs移植到神经损伤部位后如何继续维持其高表达BDNF尚需进一步研究。

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作者单位：上海市松江区中心医院骨科，松江区中山中路748号 201600