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【摘要】 探讨以纤维蛋白复合脱蛋白松质骨作为骨形态发生蛋白(BMP)的载体修复兔节段性骨缺损。[方法]于36只青紫蓝兔两侧桡骨干处造成1.5 cm缺损,采用三种方法进行处理:A组,植入脱蛋白松质骨、纤维蛋白、BMP的复合物;B组,植入脱蛋白松质骨;C组,空白对照。术后2、4、8、12、16周进行放射学、组织学和电镜检查。[结果]A组骨缺损区在成骨活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于B组,使骨缺损得到了较彻底的修复。B、C两组均不能产生骨性愈合。[结论]脱蛋白松质骨复合纤维蛋白是较理想的BMP载体材料,以三者的复合物修复骨缺损可达到满意效果。
【关键词】 脱蛋白松质骨 纤维蛋白 BMP 组织工程 骨缺损 修复
Efficacy of deproteinised cancellous bone combined with BMP and fibrin in healing of rabbit segmental radial defect∥DENG Gang,LIU Xing-yan,CHEN Ke-ming,et al.Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730010,China
Abstract [Objective]To repair segmental bone defect with the composite of deproteinised cancellous bone,bone morphogenetic protein (BMP) and fibrin.[Method] Bone defects were created in 36 New Zealand rabbits on the bilateral radii and treated with three kinds of implantations:A,composite of deproteinised cancellous bone,BMP and fibrin;B,of deproteinised cancellous bone;C,blank control.The defects were observed by entgenography,optical microscopy, and electron-microscopy at 2,4,8,12,16 weeks.[Result] The defects treated with A implantation regenerated much more new bone and bridged earlier than the defects treated with B implantation and got completely repaired 16 weeks after operation.The defects with B and C implantation couldn’t get osseous tissue healing.[Conclusion]The composite of deproteinised cancellous bone,bone morphogenetic protein (BMP) and fibrin can be effectively used to repair segmental bone defect.
Key words:deproteinised cancellous bone; fibrin; bone morphogenetic protein (BMP); tissue engineering; bone defect; repair
骨具有再生和修复能力,因肿瘤切除、外伤、骨异常生长所造成的骨缺损,在单纯依靠骨自行修复无法愈合的情况下,则需采用手术治疗。自体骨移植是一种较好的治疗方法,已被广泛应用于临床。但其来源有限,不能满足临床需求,而且对患者造成创伤,于是人们把眼光转向能促进组织或细胞生长、分化和增殖的材料。本实验就异体脱蛋白松质骨复合纤维蛋白、BMP修复兔桡骨缺损的方法和机制进行探讨,以评价复合材料作为骨组织工程材料的作用。
1 材料和方法
1.1 植入材料的制备
1.1.1 异体松质骨的制备 取青紫蓝兔(兰州生物制品研究所提供)脊柱骨、骨盆骨、长骨干骺端,剔除骨膜和软组织,去除其表面皮质骨,制成直径约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小松质骨颗粒,用流动自来水反复冲洗骨粒4~5 h,致无血渍浸出为止,将其放入蒸馏水三角瓶中,摇床上震动4~5 h。其间每30 min换蒸馏水一次,再将其放入超声波清洗机中反复进行清洗,每次30 min,清洗3~5次,自然晾干后,将其放入甲醇与氯仿(1∶1)混合液中,不时搅拌,12 h更换混合液,倒弃混合液,蒸馏水冲洗骨粒3次,自然晾干。用0.6 mol/L HCL脱钙5 min,蒸馏水冲洗3次, 自然晾干,转入30%过氧化氢中,不时搅拌,12 h更换过氧化氢液一次,处理24 h,蒸馏水冲洗3次,自然晾干,转入-80℃深低温冰箱冷冻保存。
1.1.2 BMP及纤维蛋白的提取 按照Urist [1]报道的方法从小牛新鲜皮质骨中提取,提取物置-4℃保存。纤维蛋白原用冷沉淀法自同种异体兔的血液中提取[2]。采集15只健康成年青紫蓝兔的抗凝全血并于3 000r/min,离心10 min,分离出血清,置-30℃冰箱冻存过夜,次日转入4℃冰箱缓慢融解,待彻底融解后,于4℃条件下离心,收集冷沉淀。冷沉淀用冷冻干燥机冻成干粉,再用重蒸水溶解,配成120 mg/ml的纤维蛋白原溶液。
1.1.3 脱蛋白松质骨/BMP复合物的制备 将深低温保存的异体脱蛋白松质骨取出,冷冻干燥机干燥,装入培养皿中, 1.0×106rads60Co辐照(兰州辐照中心),将100 mg提取的小牛骨形态发生蛋白溶于10 mL的4 mol/L的盐酸胍溶液中,加入10 g异体松质骨颗粒,4℃,充分搅拌混匀液体与固体成分,置冷冻干燥机内抽真空、透析、冻干24 h,分装。
1.1.4 脱蛋白松质骨/BMP/纤维蛋白复合物的制备 将处理好的异体脱蛋白松质/BMP复合物置于圆柱形模板内,浸没于纤维蛋白原中,按纤维蛋白胶的制备比例混入凝血酶,复合支架制备成功。
1.2 试验方法 选用青紫蓝兔36只,体质量2~3 kg不等,雌雄不限,随机分为3组。在无菌手术室中,速眠新-Ⅱ麻醉满意后,常规去毛、消毒、铺巾。取前臂纵行切口,长约3~4 cm,行双侧桡骨中段截骨,造成15 mm的骨和骨膜缺损,分别按组植入材料。具体分组见下表。创口缝合,肢体不做固定。将其分笼饲养,自由活动。术后肌注庆大霉素预防感染。分别于术后4、8、12、16周取材,每次3只。表1 试验分组情况表左侧右侧数量A脱蛋白松质骨/rhBMP/纤维蛋白复合物脱蛋白松质骨/rhBMP/
1.3 观察指标
1.3,1 X线检查 各组动物于手术当日和取材日拍双侧尺、桡骨正侧位片,观察各组内及组间术后不同时间的骨缺损愈合情况。
1.3.2 组织学观察 取材标本用10%甲醛溶液固定,常规脱钙、脱水、石蜡包埋、连续切片,行HE染色,光镜下观察骨缺损愈合情况。
1.3.3 扫描电镜观察 术后16周取A组标本,生理盐水漂洗,2.5%戊二醛固定,0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次后用1%锇酸固定2 h,50%、70%、80%、90%、95%丙酮梯级脱水各15 min,醋酸异戊酯15 min浸泡,干燥,镀膜,电镜观察。
1.3.4 大体标本 各组动物于取材当日拍摄大体标本,观察其大体愈合情况。
2 结果
2.1 X线检查
A组术后4周骨缺损两端有少量密度较低的骨痂形成,缺损区呈大片云雾状影,密度低于骨干;术后8周新骨桥接骨缺损,密度均匀,形成连续性骨痂;术后12周骨皮质已完整形成,髓腔未完全形成;术后16周骨性连接形成,髓腔再通。
B组术后4周缺损区大片云雾状影,密度低于骨干,两断端有骨痂形成;术后8周缺损区密度增高,密度仍低于骨干;术后12周新骨桥连接骨缺损,密度不均匀,骨皮质不连续;术后16周无骨性连接形成,髓腔未形成。
C组术后4周骨缺损两端有少量骨痂形成;术后8周骨缺损两端有少量骨痂形成,无骨性连接;术后12周骨缺损两端有少量骨痂形成,无骨性连接;术后16周骨缺损两端有少量骨痂形成,无骨性连接。
2.2 组织学检查
HE染色A组:术后2周骨缺损两端可见骨痂形成,移植物周围见反应性细胞;术后4周宿主结缔组织、纤维组织长入植骨材料周边,可见肉芽组织,少量炎症细胞,有少量软骨形成,见少量成骨细胞;术后8周植骨材料有吸收表现,新生软骨连接成片,可见成骨细胞,有较多编织骨形成;术后12周植骨材料周围已基本吸收完全,由软骨细胞及编织骨替代,可见板状骨形成及少量骨髓组织;术后16周植骨材料已基本吸收完全,仅中间有少量残余,软骨细胞已被板状新生骨代替,可见骨髓组织形成,髓腔再通。
HE染色B组:术后2周骨缺损两端可见骨痂形成,移植物周围见反应性细胞;术后4周植骨材料周围肉芽组织形成,可见少量炎症细胞,无明显新生软骨及骨形成,可见少量成骨细胞及成软骨细胞;术后8周植骨材料周围可见软骨细胞,局部成岛状,无新生骨形成;术后12周植骨材料周围已基本吸收,可见岛状软骨,少量新生编织骨无板状骨及骨髓形成;术后16周植骨材料已基本吸收,仅少量残余,可见大量新生编织骨和新生软骨,有板状骨形成,可见少量骨髓组织。
HE染色C组:术后2周骨缺损两端可见骨痂形成,移植物周围见反应性细胞;术后4周骨缺损两端,有少量骨痂形成,可见肉芽组织及验证细胞;术后6周骨缺损两端骨痂形成;术后8周骨缺损两端有少量新生软骨;术后12、16周骨缺损两端有少量新生编织骨及板状骨形成,无骨髓组织。
2.3 扫描电镜检查 A组术后16周材料己完全吸收,可见新生骨小梁,表面可见小的滋养血管。
2.4 大体标本 A、B、C组术后16周均取大体标本观察图片:A组术后16周可见骨缺损已骨性愈合;B组术后16周,可见骨缺损有少量骨性连接,骨皮质不连续,尚有0.5 cm缺损;C组术后16周,骨折缺损未愈合(图1~4)。
3 讨论
松质骨经脱蛋白、脱脂、脱钙等处理后形成大小不等、相互交通、表面粗糙、开放的孔隙和高度的空隙间连接,这增加了细胞—材料间的接触面积,对种子细胞的早期黏附以及营养物质供给、代谢产物运送和血管化均十分有利,适合新生骨组织的长入。将其与BMP、VEGF复合,植入宿主体内后多点成骨,效果满意。但由于组织相容性抗原差异,新鲜移植会诱发宿主的免疫排斥反应,导致愈合过程延迟甚至失败。本实验采取了脱蛋白、脱脂、冻干、深低温冷冻、60Co辐照等方法,抑制组织相容性抗原,植入体内不会刺激宿主产生抗HLA抗体,临床应用不需组织配型。术后各组伤口均未出现红肿、渗出,伤口愈合好,组织学切片也未见明显淋巴细胞浸润,表现出良好的组织相容性。 图1aA组术后2周 骨缺损两端可见骨痂形成,移植物周围反应性细胞 图1bA组术后4周宿主结缔组织、纤维组织长入植骨材料周边,可见肉芽组织,少量炎症细胞,无明显骨形成,有少量软骨形成 图1cA组术后6周植骨材料周围炎症细胞、肉芽组织已吸收,植骨材料周围骨小梁内可见成软骨细胞及新生软骨,局部成岛状,植骨材料无明显吸收表现,有少量编织骨形成 图1dA组术后8周植骨材料有吸收表现,新生软骨连接成片,可见成骨细胞,有较多编织骨形成 图1e、fA组术后12周植骨材料周围已基本吸收完全,由软骨细胞及编织骨替代,可见板状骨形成及少量骨髓组织 图1gA组术后16周植骨材料已基本吸收完全,仅中间有少量残余,软骨细胞已被板状新生骨代替,可见骨髓组织形成,髓腔再通 图2aA组桡骨缺损造模 图2bA组术后4周,骨缺损两端有少量密度较低的骨痂形成,缺损区呈大片云雾状影,密度低于骨干 图2c术后8周新骨桥接骨缺损,密度均匀,形成连续性骨痂 图2d术后12周骨皮质已完整形成,髓腔未完全形成 图2e术后16周骨性链接形成,髓腔再通 图3aA组术后16周大体图片,可见骨缺损已骨性愈合 图3bB组术后16周大体图片,可见骨缺损有少量骨性连接,骨皮质不连续,尚有05cm缺损 图3cC组术后16周大体图片,骨折缺损未愈合 图4aA组16周电镜照片可见材料已吸收,表面有较多骨细胞,可见小的滋养血管 图4bA组16周电镜可见新生骨小梁 纤维蛋白作为粘合剂已在外科临床广泛应用,并具有抗原性低,降解吸收性好,促进血管化和骨传导等多种特性和生理功能[3],同时其还具有良好的可塑性,可以根据需要制成各种形状。新鲜制备的纤维蛋白凝胶具有一定的抗压性和弹性,植入缺损区后不必采取固定或支撑措施;另外纤维蛋白与BMP复合的工艺简单[4]。实验结果表明,植入复合物的骨缺损区在成骨活动的活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于对照组,并使骨缺损得到了较彻底的修复。IsogaiN等[5]将培养后的牛骨膜细胞与FG混合植入裸鼠背部皮下,12周时形成了新骨,而单纯FG无新骨形成,证明了其具有骨诱导能力。陈克明等[6]也证实了纤维蛋白胶作为骨组织工程载体的可行性。目前纤维蛋白胶主要在可注射型组织工程骨中应用。Kawamura等[7]报道,BMP与纤维蛋白复合后骨诱导活性显著提高。纤维蛋白是一种低抗原的生物大分子材料,易于降解,可塑性良好,在多方面符合骨组织材料载体的理想条件。
骨折的修复是一个复杂的过程,受多种激素,全身及局部生长因子调控,对骨的形成和生长起到重要作用。BMP即骨形态发生蛋白,来源于骨及骨源性细胞的特异性生长因子,其靶细胞为血管周围的周细胞、内皮样细胞、成纤维细胞样细胞及多能干细胞。BMP作用于靶细胞后,可使间充质细胞聚集,定向分化为具有不同功能特点的生骨细脑,通过软骨内骨化及膜内骨化而成骨。Urist[8]等提出诱导成骨理论以后,人们认识到以BMP为主的一系列骨生长因子的作用,作者按照其提出的方法制备了BMP,经过多次成骨性能研究证实其活性好、且稳定。人们在应用修复骨缺损修复的研究时,常将它与一些能充当其缓释载体并能发挥支架作用的材料进行复合移植。
作者将脱蛋白松质骨、纤维蛋白、BMP复合在一起,充分发挥了其各自优势。实验结果表明,脱蛋白松质骨主要作为支架,因为其良好的孔隙和三维结构给骨的生长提供了充分的表面积和空间,这有利于成骨和血管组织的长入。纤维蛋白一方面起纤维支架的作用,另一方可以阻止BMP因血流的冲刷而造成的流失,且可起缓释作用,使BMP能均匀释放,发挥其最大的成骨效应。BMP具有使未分化的间充质细胞定向分化为骨细胞,并形成骨组织的能力,在修复骨质缺损和促进骨折愈合等方面发挥重要作用。
【参考文献】
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[4] 陈克明,李旭升,刘兴炎,等.骨形态发生蛋白复合纤维蛋白载体修复骨缺损的实验研究[J].中华骨科杂志,1998,18:68.
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[6] 陈克明,葛宝丰,刘兴炎,等.骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复大面积关节软骨缺损[J].中国矫形外科杂志,2004,12:444.
[7] Kawamura M, Urist MR. Human fibrin is a physiological delivery system for bone morphogenetic protein[J]. Clin Orthop, 1988, 235: 302-310.
[8] Urist MR, Delange RJ, Finerman GAM. Bone cell differentiation and growth factors. Induced activity of chondro-os-teogenetic DNA[J].Science, 1983,220:680.
作者单位:兰州大学临床医学院,兰州 730010