三种骨移植材料的骨诱导活性对比实验研究

【摘要】  　　目的 通过对人工骨硫酸钙(CS)、同种异体和异种脱矿骨(DBM)3种骨移植材料异位诱导成骨效应的观察，比较其骨诱导活性优劣，为临床选择合适的骨移植材料提供参考依据。[方法]采用大鼠股部肌袋内埋植实验。选择成年斯普拉大鼠共36只，随机分成A、B 2组，每组18只。A组左侧植入CS(A1)，右侧植入同种异体DBM(A2);B组左侧植入异种DBM(B1)，右侧不植入任何材料行空白对照(B2)。通过异位诱导成骨实验，在植入后2、4、6周取材作大体、组织形态学观察及碱性磷酸酶(ALP)和钙离子生化测定，对不同材料的骨诱导活性进行评价。[结果]术后2周，2种DBM被纤维组织包裹，可观察到DBM骨片周围间充质细胞聚集;4周时可见软骨细胞、成骨细胞形成;6周时有类似软骨基质样物质形成;ALP和钙离子含量在各时间段均高于对照组，说明2种DBM具有骨诱导活性，其结果差异具有供体依赖性。而CS降解吸收快，炎症反应轻，未见诱导成骨现象。[结论]2种DBM具有骨诱导活性，同种异体DBM较好，异种DBM次之，供体的差异性和DBM的制备可影响其在体内的骨诱导活性。CS生物相容性较好，是可供选择的骨修复填充材料。

【关键词】  脱矿骨 硫酸钙 骨移植 骨诱导活性

　　Comparison of osteoinductive activity of three types of bone graft materials∥ YOU Yonggang,XU Yongqing,TANG Hui,et al.Department of Orthopedics,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan 650032,China

　　Abstract：To compare the osteoinductive activity of calcium sulfate (CS),allogenetic demineralized bone materials (ADBM) and heterogenetic demineralized bone materials (HDBM) by observing their efficiency in inducing bone formation.CS,ADBM and HDBM were transplanted into thigh muscle pouches of mice.Thirtysix mature SpragueDawly mice were divided into 2 groups at random.CS was transplanted into the left(group A 1,n=9) and ADBM into the right (group A2,n=9) thigh muscle pouches.HDBM was transplanted into the left thigh muscle pouches (group B 1,n=9) and the right sites were taken as blank controls (group B2,n=9).Experiments were done to induce ectopic bone formation.At 2,4,6 weeks postoperatively,specimen were collected to evaluate gross and tissue structures and biochemical tests for alkaline phosphatase (ALP) and Ca2+ so that osteoinductive activities of different bone graft materials could be assessed.At 2 weeks postoperativly,ADBM and HDBM were wrapped up by fibrous tissues and stromal cells gathering around the DBM slices.At 4 weeks postoperativly,formation of cartilage and osteoblasts were observed,and at 6 weeks,materials like cartilage matrix were observed to grow.The concentration of ALP and Ca2+ in study groups was higher than that of control group,which meant that 2 types of DBM had osteogenic potential and that the differences of osteogenetie potential in ADBM and HDBM relied on the donors,whereas CS could be degraded and absorbed fast with light inflammatory reaction and no ectopic bone formation was observed in CS graft.Both ADBM and HDBM have osteoinductive potential.ADBM is better in inducing ectopic bone formation than HDBM.Differences in donors and preparation of ADBM and HDBM have impacts on their abilities of inducing ectopic bone formation.CS is good at biocompatibility and could be used as bulking agents to repair bone defects.

　　Key words：demineralized bone; calcium sulfate; bone transplantation; osteoinductive activity

　　由于创伤、感染、肿瘤或骨病等原因造成骨缺损、骨不连和骨髓炎者越来越多，使得临床上需要进行骨修复治疗的患者也越来越多，因而刺激了骨移植材料的极大发展。骨移植已由单纯的自体骨发展到同种异体骨、异种骨及人工骨移植。而产生骨生成的诱导作用又是任何一种骨移植术的主要目的[1]。自体骨无疑是临床骨移植的金标准，但其来源受到极大限制。同种异体和异种脱矿骨基质(demineralized bone martrix，DBM)因含有骨形态蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、转化生长因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)和胰岛素样生长因子等多种诱导成骨生长因子，从而具有骨诱导特性已经实验所证实[2,3]。许多人工骨移植材料如硫酸钙(calcium sulfate，CS)的骨诱导作用也有报道[4,5]。面对众多不同种类的骨移植材料，如何选择才能最大效应发挥骨诱导活性作用一直是临床骨修复治疗需要深入研究的问题。本实验通过用同种异体、异种DBM和人工骨CS在大鼠股部肌袋内埋植的骨诱导活性实验进行对比研究，为临床上骨移植材料的选择提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 同种异体DBM及异种DBM的制备[6] 选择大鼠、兔股骨取材，去除软组织，经50℃温水冲洗清除血液与骨髓组织，裁锯成骨颗粒，用1∶1氯仿/甲醇脱脂12 h，而后用8.8 mol/L(30%)H2O2脱蛋白48 h，再用0.6 mol/L HCl表面脱钙5 min，调整pH值至7.4，冻干，经环氧乙烷消毒后备用。

　　1.1.2 本实验用CS为美国Wright医疗技术有限公司以CS为基质研制生产出新一代骨移植替代产品Osteoset，成分为半水硫酸钙(CaSO4·1/2H2O)，规格为直径4.8 mm、体积10 ml、重10 g的圆柱状颗粒。

　　1.2 实验动物分组及手术方法

　　健康成年SpragueDawly大鼠36只(由昆明医学院动物实验中心提供)，雌雄对半，体质量229～358 g，平均292 g，随机分成A、B 2组，每组18只。大鼠股部肌袋埋植材料如下：A组：左侧CS颗粒(A1)，右侧同种异体DBM颗粒(A2);B组：左侧兔异种DBM颗粒(B1)，右侧行空白对照(B2)。手术前使用2%的戊巴比妥钠行腹腔麻醉。大鼠双侧股部剃毛后常规消毒铺巾，在无菌条件下于大腿中部切开皮肤，切口长约2 cm，钝性分离肌肉，造成股部肌袋，实验侧按上述分组植入不同骨移植材料，B组右侧(B2)行单纯手术分离，不植入任何材料。手术完毕逢合肌肉皮肤，雌雄大鼠分笼饲养，动物苏醒后自由活动。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 大体观察 术后观察大鼠切口反应、活动及饮食等基本情况。各组动物分别在术后2、4、6周3个时间段处死取材，每组每个时间点各6只，每组各时间点每侧取2份标本，1份标本制备组织匀浆作生化分析，另一份作组织学切片观察。取出各组实验侧材料及其周围组织，剖开组织和材料界面，观察软组织包绕情况和肌肉有无异常，埋植材料的降解吸收情况，并与对照侧取出的软组织对比观察。

　　1.3.2 生化检测 标本取材后去除周围软组织，称重、剪碎、置于玻璃匀浆器中，加入2 ml生理盐水研磨成匀浆，吸入离心管中，用1 ml生理盐水洗匀浆皿2次，均吸入同一离心管，4 000 r/min离心15 min，取上清液测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量。取上清液离心沉淀物用盐酸消化后测定钙离子含量。

　　1.3.3 组织形态学观察 将各组不同时间段的取材标本用10%福尔马林液固定24 h，将含有DBM的标本经硝酸脱钙12 h等处理后常规石蜡包埋，经切片、HE染色后在光学显微镜下观察组织形态。

　　1.3.4 统计学方法 所有数据用SPSS 11.5统计包软件处理，以均数±标准差表示，采用多组随机计量资料的多因素方差分析，P<0.05为有统计学意义;组间配对进一步行两两均数比较的SNk-q检验。

　　2 实验结果

　　2.1 实验动物一般情况及大体观察

　　所有动物均顺利完成手术，术后观察期间，动物饮食、活动良好，各组实验动物伤口无肿胀，无脓性渗出，伤口愈合良好，动物全部存活。同种异体DBM和异种DBM组在2、4、6周不同时间段骨基质未见明显吸收，植入物被周围纤维组织紧密包裹，肌肉未见坏死。CS植入物在2周时已明显吸收降解，颗粒缩小;在4周时降解为无定形的“豆腐渣”样坏死物质，包囊疏松;至6周时已基本完全降解吸收，肉眼只观察到少量残留的CS存在。

　　2.2 钙及碱性磷酸酶含量统计学结果

　　不同时间点实验组的钙均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步组间对比分析，除CS和对照组的ALP含量外，其余各组差异有统计学意义(P<0.05)。实验侧同种异体DBM的ALP和钙离子含量均高于异种DBM(P<0.05)。结果见表1、2。

　　2.3 组织学切片观察结果

　　组织学检查观察到对照组只有轻度纤维化表现。CS组炎症反应轻微，异物反应小，完全降解吸收在6周左右，周围软组织未见坏死，后期肌肉纤维化表达增加，未见诱导成骨现象。同种异体DBM和异种DBM两组均具有诱导成骨反应。实验组2种DBM术后2周，可见植入的DBM被纤维组织包裹，并有间充质细胞向DBM移行聚集。4周时，脱矿骨片周围软骨细胞活跃，并开始分泌形成软骨基质。术后6周，DBM边缘已有类似软骨基质物形成，成骨明显(图1～5)。

　　为观察DBM颗粒存在、缺乏和成骨情况，通过一个定性的评分系统描述进一步对同种异体DBM和异种DBM的骨诱导活性行组织学评分[7]，将实验植入的2种DBM组织学切片放大10倍，根据以下情况进行骨诱导活性评分：切片上没有DBM或新的组织出现并且在平均水平上没有诱导现象记为“0”分;当观察到DBM但没有新骨或软骨细胞出现记为“1”分;当观察到有软骨细胞、成骨细胞或单个小骨片形成记为“2”分;当观察到有软骨基质形成或更多的小骨片出现记为“3”分;当在切片上观察到新生骨片覆盖达70%记为“4”分。其评分结果显示，2种DBM的骨诱导评分随时间变化增高，差异具有统计学意义(P<0.05)(图6)。　表1 标本中ALP水平组别ALP含量表2 标本中钙离子含量组别钙离子含量

　　图1 术后2周，实验组DBM骨片被纤维组织包裹、间充质细胞迁移聚集(HE×200) 图2 术后4周，成骨细胞附着于DBM骨片边缘聚集分化(HE×400) 图3 术后2周，实验组DBM骨片周围间充质细胞转变成为大量的软骨细胞(HE×100) 图4 术后4周，软骨细胞分化成熟，逐步形成软骨基质(HE×400)。图5 术后6周，实验组DBM骨片周围软骨基质合成、钙化，软骨基质形成(HE×200) 图6 2种DBM材料的骨诱导活性评分如图所示，随时间变化2种DBM的骨诱导分值增高，同种异体DBM较好，异种DBM次之。

　　3 讨 论

　　成功的骨修复治疗是基于骨再生的生物学基础，需要3种基本元素的相互作用：细胞、生长因子和良好的支架材料[8]，亦即所谓的骨组织工程学。这与骨愈合机制的自身成骨作用(细胞)、骨诱导理论(生长因子)和骨传导理论(支架材料)这三大学说是相一致的。只要骨折存在，无论有无骨移植，骨诱导均在骨愈合机制中发挥着重要作用。在骨诱导所必备的诱导刺激物(生长因子)、被诱导靶细胞(间充质细胞)和有利于新骨形成的血液供应环境这三个要素中，有2个要素是和骨组织工程学相同的。由此可以看出骨诱导理论在骨愈合机制三大学说中的重要性。基于上述理论，如何选择适合的、具有骨诱导活性的骨移植材料以及如何才能发挥骨诱导活性促进骨愈合的最大效应则成为临床研究的热点问题。

　　骨诱导活性定义为一种材料诱导骨形成的能力。由于在应用一种具体的骨移植材料时，容易与骨传导性相混淆，并且也会和实际上不是未分化的间充质细胞向成骨细胞谱系转化而提高成骨活性的材料混淆，因而要说明在骨质正常部位的骨诱导性是困难的。为避免这些问题，在老鼠这样的动物肌肉内植入不同材料，并且在不同时间段观察成骨情况的实验是经常使用的一种评价方法。这种方法评价骨诱导活性的过程，依赖于在肌肉内，材料能够诱导间充质细胞进入软骨内发挥通路的能力。人出生后，间充质细胞演变为基质干细胞，其中一部分存在与骨膜纤维层、血管周围及软组织，具有多能、多向分化特点的非骨源性细胞，被称为诱导性骨祖细胞(induced osteoprogenitor cell，IOPC)。IOPC在各种力学因素、生物生理因子及生物化学因子等的刺激下，可转变为成骨细胞或软骨细胞，从而具有形成异位骨(或软骨)的能力。BMP正是目前发现的最重要的异位骨形成诱导因子，是通过对细胞的趋化性、丝裂源性和诱导分化性这三种作用诱导IOPC向骨系细胞分化而产生骨诱导作用的。

　　有关DBM异位诱导成骨的实验屡见报道。黄长明等[3]在用同种异体骨和自体骨修复兔股骨干缺损模型的实验研究显示，同种异体骨中的BMP表达与自体骨相似，免疫组化观察到新生编织骨中BMP表达活跃。因而得出结论，同种异体骨移植中的骨吸收和骨诱导是同时进行，骨诱导在异体骨愈合早期发挥了重要作用。因此，经过适当的、化学的和热采集方法处理后的DBM中骨诱导生长因子BMP容易释放，有利于骨细胞增殖和成骨[9]。DBM实为BMP提取的初级产物。本实验中在大鼠股部肌袋埋植入的同种异体、异种DBM材料因含有BMP，具备诱导成骨的三个必备条件，通过上述途径显示出了一定的诱导成骨活性。而且经组织学切片显示，DBM实验材料在2周时确也观察到了软骨细胞的存在，后期软骨基质形成钙化现象。相比之下，同种异体DBM的骨诱导活性较好，异种DBM次之。这是因为DBM的制备、含量和供体的差异性对骨诱导活性有着重要的影响[10]。

　　ALP是成骨细胞功能和分化的指标，成骨细胞活跃时具有合成ALP的功能，其表达情况可指示间充质细胞向成骨细胞或软骨细胞的分化。骨特异性ALP定位于骨源性细胞的表面，是细胞向成骨细胞分化的重要标志，也是评价机体成骨活性和组织分化能力的特异性标志酶。因此，ALP是诱导成骨性标志，测定细胞内ALP含量变化具有重要意义。同时，在骨形成过程中，钙盐会在骨基质中沉积，因而钙含量测定也是目前国内外评价BMP异位骨诱导作用时经常使用的方法。本实验的研究结果显示，2种DBM实验组的ALP、钙离子含量在不同时间段均高于对照组，差异有统计学意义。说明实验材料DBM可释放出骨诱导生长因子BMP，促进间充质细胞向成骨细胞或软骨细胞分化、成熟，并进一步钙化形成软骨基质，通过异位诱导成骨效应表现出不同的骨诱导活性。

　　CS作为骨移植材料应用于临床已有100多年的历史，在人体内的安全性早已被众多实验所证实。其具有组织相容性好，骨诱导活性、生物降解后形成的微酸性环境及磷酸钙晶体能够吸引破骨细胞，加速新骨形成等特点[11]。本实验中CS吸收快、炎症轻、异物反应小、周围组织未见坏死，进一步证实了其良好的生物相容性和降解性。有关CS能够增强成骨作用的确切机制是不明确的。认为CS具有骨再生作用是CS微粒能够与相连的骨紧密结合的一种结果，结合它作为一种可吸收材料的性能引导新骨形成。Walsh等[4]用CS片剂填充于阉羊股骨缺损模型，观察到骨形态蛋白(BMP)-2、(BMP)-7、TGF-β和血小板衍生生长因子反应增强，认为CS有助于刺激骨形成。张健等[5]通过用CS与自体髂骨在兔腰椎融合模型的成骨实验研究中发现，两者的成骨能力在组织学和影像学上没有任何差别，因而认为CS可能具有骨诱导性，其成骨能力与自体髂骨相当。但这些发现仅仅支持CS只是一种具有较好生物相容性的骨修复填充材料。本实验中，CS降解后虽然在局部形成了较高的钙离子浓度，但结合异位诱导成骨的三个必备条件，缺乏诱导成骨的生长因子，加之未直接在骨缺损修复中进行实验，因而未观察到诱导成骨现象。其次，ALP含量统计与对照组无差异，说明无成骨细胞存在。这也符合CS在有骨或骨膜存在的情况下，能够诱导成骨、促进骨再生，而在无骨或骨膜存在的条件下不能刺激骨生成的特性。

　　综上所述，本研究结果显示，同种异体和异种DBM均具有骨诱导活性，同种异体DBM较好，异种DBM次之。尤其是同种异体DBM，可通过制备过程、供体的选择对其物理特性加以处理，从而提高其在体内的稳定性和骨诱导活性，有望成为骨修复治疗中替代自体骨的一种良好的骨移植材料。而CS具有良好的生物相容性和降解性，是临床可供选择的骨移植材料。

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作者单位：1.成都军区昆明总医院 全军骨科中心 a.骨科;b.病理科,昆明 650032;2.昆明医学院附一院外科教研室,昆明 650032