三维多孔复合人工骨的制备及性能检测

【摘要】  ［目的］研制新型三维多孔复合人工骨材料并评价其相关性能。［方法］将海洋贝壳牡蛎粉、消旋聚乳酸按一定比例复合，采用热致相分离法 制备多孔复合人工骨（CAB）材料，检测其孔隙率、孔径、生物力学强度；并将CAB和纯PLLA薄片浸泡于37℃平衡液中，观测不同时间点CAB和纯PLLA体外降解变化参数,对其结果进行统计学比较。［结果］研制的CAB材料平均孔隙率为85. 1％；电镜下孔径测量大小为100～ 300 μm，孔隙之间的连通较好，孔隙形态、取向规则有序；压缩强度为2. 12 MPa；在观测周期内，随着浸泡时间的延长，CAB和纯PLLA的质量损失率、浸泡液pH值呈现出规律性变化，两组各时期的各项指标比较具有显著性差异（P﹤0. 05）。 ［结论］ 该法制得的CAB材料的孔隙率、孔径、生物力学强度、体外降解性能表明能满足骨替代材料的要求。

【关键词】  骨替代材料; 牡蛎粉; 聚乳酸; 人工骨; 热致相分离法

Preparation  of  new  porous  composite  artificial  bone  and  properties∥SONG Shifeng，PENG Lei，WANG Zhen,et al.Department of Orthopaedics,Hainan Provincial People's Hosipital,Haikou 325027,China

    Abstract：［Objective］To prepare a  new  porous  composite  artificial  bone  substitute  and  evaluate  its  properties.［Method］Thermally induced phase separation was adopted  to  prepare  the  artificial  bone  made  from oyster  shell  powder  and  PLLA  which  were  proportionally  mixed  and  its  properties  as  porosity  rate,pore  size and  mechanical  strength were assessed.Meanwhile  the  related  variation  parameters  were  examined  every  2  weeks in  a  course  of  14  weeks  after  the  slices  of  CAB  and  pure  PLLA were  immersed  in  NS  of  37℃  in  vitro ，the  results  of  which  were  compared  in  statistics.［Result］The average porosity  rate of artifical  bone  with TIPS  method was  85.1%  and   pore  sizes  ranged  100-300  μm  under  the  SEM,with  better  pore  connectivity  and  regulation  shape.The average  compressive strength  was 2.12 MPa.As the  immersion  prolonged,the regular variation  was  observed  about the  mass  loss  of  CAB and  the pH  alteration  of  solution,there  was  statistically  difference in  the indexes  between  the  two  groups （P﹤0.05）.［Conclusion］The  porosity  rate,pore  size,mechanical  strength  and　degradation  performance  in  vitro  of  the  artifical bone  made  by  TIPS  method  can  satisfy  the  requirement  of  bone  substitute .

    Key words：bone  substitute;     oyster  shell power;     polyLlactic  acid;     artifical  bone;      TIPS

     骨缺损修复一直是困扰着矫形外科和骨科医生的一个难题，每年都有大量的病人因各种原因导致骨缺损难以修复，人工骨移植材料在最近几十年得以迅速发展，但或多或少都存在价格昂贵，来源紧张，其综合性能难以令人满意。作者所采用的牡蛎壳粉为海南三亚海域近江贝壳粉末，其主要成分为文石型碳酸钙，是一种理想的生物源性成骨材料。碳酸钙为主体的生物材料因其本身的Ca2+、CO2-3存在于正常人体液中，其具有更为良好的生物相容性，与人体骨成长过程的类似性，成为近几年来骨修复体研究的新热点。有机高分子材料消旋聚乳酸（PLLA）具有降解快且完全、成型好等特点，与牡蛎壳粉复合，可以弥补其不易成型，缺乏有效的机械强度等缺点［1～ 3］，作者采用热致相分离法（TIPS）可制备出一种新型的骨替代材料并对其性能进行检测。

    1     材料与方法

    1.   1     材料

    消旋聚乳酸（PLLA），相对分子质量为80KD，为白色颗粒状；牡蛎壳取自海南无污染三亚海洋贝壳牡蛎粉；1,4－二氧六环（市售分析纯）。

    1.   2     制备方法及检测

    1.   2.   1     热致相分离法制备     将PLLA 溶解于1，4 - 二氧六环中制成10％（w/v）的溶液，在磁力搅拌器中搅拌24 h充分溶解成无色透明溶液；超声振荡，在溶液中以一定质量比加入牡蛎壳粉，振荡均匀、冰箱过夜；将匀浆材料负压冻干72 h；材料冷冻干燥完毕后置入烘箱，室温下冷却；将所得材料根据需要切割成不同形状，环氧乙烷消毒，封存备用。

    1.   2.   2     CAB的性能检测     (1)扫描电镜观察：用扫描电镜对材料的断面进行观察，每个样品随机取3 个视野X线片，逐个测量照片上孔隙的孔径，计算出样品的平均孔径；并对孔隙结构及孔隙间的交联进行观察。

    (2)孔隙率的测定：在25℃条件下测定，选用一个比重瓶，加满无水乙醇并称质量（w1）；把质量为（W0) 的样品浸入乙醇中，抽真空，使样品中的气体完全被乙醇取代，待比重瓶补满乙醇后称质量（w2）；将浸透了乙醇的样品取出，称剩余的乙醇与比重瓶的质量（w3）。按公式ε= w2- w3- W0/（ w1- w3）×100%计算， 测得材料的孔隙率；

    (3)生物力学强度的检测  采用INSTRON 1122万能材料试验机上用10 kN的力进行测定，抗压强度为试样型变1 mm时单位面积所承受的最大压力（MPa）。

    1.   2.   3     CAB的体外降解实验

    将CAB材料和纯PLLA材料均匀切割成直径5 mm，厚3 mm的薄片，环氧已烷熏蒸消毒，称得质量为W0。实验分2组：CAB组和纯PLLA组，每组35个样品，在容积为50 ml的无菌试管中加入10 ml的平衡液中，CAB组和纯PLLA组分别加入CAB材料和纯PLLA材料各1片，密封管口后静置于37℃的恒温箱中，分别于2、4、6、8、10、12、14周取出材料，肉眼观察浸泡液的变化，并进行材料质量减少率的测定，降解液的pH值变化等测定。

    1.   2.   4     数据采集     采用SPSS 12.   0统计软件分析，材料的各种性能参数直接通过样本值求算术均数，体外降解实验中的组间比较采用t检验。

    2     结     果

    采用TIPS法制备的CAB材料据固化模具的不同可加工成圆柱状、条状、块状等，材料外观呈白色，质地均匀、坚硬，表面粗糙，材料表面肉眼可见密布的、连续的微细孔隙。

    2.   1     制得材料的主要性能结果

    2.   1.   1     扫描电镜观察结果     见图1，可以观察到材料横断面相互交联贯通的大孔结构，呈长条纵深状，孔隙形态、取向规则有序，孔隙大小为100 ～ 300 μm，孔壁上可见大量孔径数微米的微孔。

    图1     多孔复合材料（CAB）的电镜观察2.   1.   2     孔隙率的测定     孔隙率的测定结果在83.   2％～ 92.   1％之间，平均孔隙率为85.   1％。

    2.   1.   3     强度的测定     压缩强度的测量结果平均为2.   12 MPa，而纯PLLA的压缩强度平均为0.   82 MPa。

    2.   2     CAB材料和纯PLLA的体外降解实验

    2.   2.   1     在整个实验周期内，CAB组浸泡液随着时间的延长略有混浊，出现少许的悬浮微粒，无明显的沉淀，纯PLLA组的浸泡液则基本保持澄清，浸泡14周后，材料仍维持原来的形状，材料无明显的开裂、崩解，但表面变的较为粗糙。

    2.   2.   2     图2、3分别为纯PLLA、CAB在体外降解中质量损失率和降解液的pH值随时间的变化规律。从图中可以看到，复合人工骨材料CAB在降解的各个时期质量损失率都要比同时期的纯PLLA低，两组各时期的两项指标比较均有显著性差异（P<0.   05）,因此可以看出牡蛎粉对PLLA的降解有一定的抑制作用。

  　　由图3可以看到，纯PLLA随降解时间的延长其溶液pH值有逐渐下降趋势，而复合材料的浸泡液pH值在开始2周内有明显上升，而在此之后就逐渐出现下降趋势，到第12周后浸泡液的pH值基本达到平衡，复合支架所表现出的这种特性，对于消除PLLA降解产生的酸性物质所引起的无菌性炎症反应有很大的意义。

    3     讨     论

    海洋生物外壳主要成分是文石型碳酸钙，并含有丰富的氨基酸和微量金属元素。尽管牡蛎壳和骨组织并非同源，但它们的形成机制却有类似之处。这将为我国沿海资源丰富的牡蛎壳开发成为具有良好性能的骨修复材料提供了理论上的可能［1～ 6］。牡蛎粉是天然的无机材料，聚乳酸是合成的有机材料，这两种材料不仅生物相容性良好，而且来源丰富，具有较大的开发潜力。通过特定的制备工艺将这两种材料组合在一起后，利用聚乳酸良好的机械强度和热塑性能，可以赋予重组材料适宜的机械强度，并可根据需要任意塑形。另一方面，牡蛎壳粉不仅可以改善聚乳酸亲水性不足的缺陷，而且因其碳酸钙成分是一种弱碱性的物质，理论上可以中和聚乳酸的酸性降解产物，从而避免或减轻该产物积聚所致的无菌性炎症［7～ 9］，提高材料的安全性。有研究者通过在聚乳酸中加入碱性材料的方法来减轻这种不良反应，取得了良好的效果［10～ 12］。

    本实验明确了热致相分离法制备牡蛎壳/聚乳酸的三维多孔框架，孔隙率较高，孔隙直径界于100～300  μm，形态自然圆润，取向规则，牡蛎壳粉在PLLA构成的孔壁中均匀分布，得到一个在整体形状和微观结构均比较满意的可植入的三维多孔支架。

    骨替代材料的三维结构是决定材料与宿主骨结合速度和完成程度的主要因素之一。具有适宜孔隙结构的材料有利于新生血管组织的长入，提高新骨生成的速度和数量。作者制备的CAB材料的孔隙率达85%左右，为新骨组织的长入提供了足够的空间，同时，其压缩强度虽不及人体平均松质骨强度，但结合目前手术中使用的内固定或外固定，其完全可以满足非承重部位骨缺损填充的要求。由于材料种类和实验方法的差异，各研究者对于骨替代材料的适宜孔径的看法并不一致。目前被大多数研究者接受的观点是：除某些降解特别迅速的材料外，骨替代材料的孔径不宜<100 μm，否则不利于骨组织的长入；另一方面，孔径>500 μm则会影响材料强度和细胞的粘附，也不利于新骨组织的形成。作者研制的CAB材料的平均孔径为100～300 μm，孔径大小适中，而且材料内部孔隙分布均匀，孔隙之间相互连通，孔隙形态、取向规则有序,有利于新生组织的长入。

    CAB材料的体外降解实验中可发现材料的质量损失率、PLLA分子量和降解液的pH值随时间的延长呈现较为规律的变化。由图2、3可见，复合人工骨材料在降解的各个时间点质量损失率要低，由此可见牡蛎壳粉对PLLA的降解有一定的抑制作用。探讨其原因可发现PLLA的降解过程为酯链的无规则断裂水解过程，表现为分子量的迅速下降，而水解产生的链端羧基又会自动催化并加速其水解，牡蛎壳粉的成分为碳酸钙，偏碱性，可以中和PLLA降解所产生的酸性，降低PLLA的酸自动催化水解速度，因此出现牡蛎壳粉对PLLA的降解有一定的抑制作用。由图3可见，纯PLLA随降解时间的延长其溶液pH值有逐渐下降趋势，而复合材料的浸泡液pH值出现先上升后下降的趋势，到第12周后浸泡液的pH值基本达到平衡。其原因主要可考虑为：在刚开始阶段，主要由于牡蛎壳粉中碳酸钙的溶解，导致浸泡液pH值出现偏碱性，后浸泡液pH值出现缓慢下降；在8周左右出现明显下降，考虑为聚乳酸开始出现大量的降解，其降解产物乳酸和牡蛎壳中的碳酸钙发生反应，使浸泡液的碱性程度下降，两种因素相互影响，最终达到一种动态平衡。

    综上所述，CAB中的构成成分牡蛎壳，聚乳酸均具有良好的生物相容性，其性能互补，材料的孔径孔隙率，生物力学强度等性能基本能满足骨组织生长的要求，有望作为一种性能优良的人工骨材料应用于临床。当然，该材料植入体内后的实际效果如何还有待动物实验和临床应用检验。

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作者单位：1.海南省人民医院创伤骨科,海口 570311; 2.第四军医大学西京医院骨科研究所,西安710032