脊髓组织工程中纳米支架材料的研究进展

【摘要】  随着纳米技术的迅速发展和广泛应用，也为脊髓组织工程生物材料的发展开辟了一个全新的领域。纳米材料因具有一些独特的效应,有利于细胞的黏附、增殖和功能的增强,使其在脊髓损伤修复的研究中将发挥越来越大的作用。

【关键词】  纳米材料; 脊髓损伤; 组织工程; 细胞支架

Progress of researches on nanoscaffold material used in spine tissue engineering∥ZHU Leyin，CUI Zhiming.The Second Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001,China

　　Abstract：With the rapid development and wide application of nano-techonology,the development of spine tissue engineering materials has been ushered into a brand field.Because of its unique effects of promoting cell adhesion,proliferation and function,nano-meterial will play more and more important role in the research on spine cord injury repair.

　　Key words：nanometer material; spinal cord injury; tissue engineering; cell scaffold

　　纳米技术(nanotechnology)是指在0.1～100 nm 量度范围内对物质结构进行研究和制造的技术。当粒子尺寸进人纳米量级时，其本身具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应，因此表现出的许多特有性质在催化、光吸收、生物医药、磁介质及新材料等方面有广阔的应用前景。在脊髓组织工程支架材料的合成与制备中，通过采用纳米技术对生物材料表面改建或者直接采用纳米材料或纳米复合材料，不仅能提高细胞与材料的黏附能力，也能提高材料的生物相容性，同时有利于细胞的分化和增殖，因此在脊髓组织工程有着良好的应用前景。现将纳米支架材料在脊髓损伤修复组织工程中的应用作一综述。

　　1 脊髓组织工程的概念

　　脊髓损伤后神经功能的恢复至今仍是困扰医学界的难题,近年来组织工程技术的兴起为脊髓损伤的恢复带来了新的希望。脊髓组织工程的基本思路是首先在体外分离、培养种子细胞，然后将一定量的种子细胞种植到具有一定形状的三维生物材料支架上，持续培养扩增，形成细胞-生物材料复合物，再种植体内，最终形成具有一定结构和功能的组织或器官。在这个体系中，细胞、支架或生物材料的构建以及细胞和材料间的相互作用是三个主要因素[1]。用于脊髓损伤修复的种子细胞目前主要有神经干细胞、嗅鞘细胞、施旺细胞等，如果单纯移植细胞治疗时移植而没有有效的支撑，周围组织易塌陷，对细胞形成挤压，使得细胞形成杂乱的凹块，轴突无法充分延伸与周围正常组织形成突触。生物支架材料为种子细胞的生长提供适宜的环境和限定的空间，防止外界其它成分的干扰和胶质瘢痕的形成，指引神经元轴突延伸，使新形成的组织接近于正常的解剖结构，有利于功能性连接的建立。支架材料及其三维结构对治疗效果具有至关重要的作用。目前应用的组织工程支架材料在物理性能、生物性能及其形态结构与正常的在体脊髓相比,都有较大的差距,尚无与脊髓三维结构高度相似且在理化性能也与脊髓相似的支架材料[2]。

　　2 传统的生物支架材料

　　细胞移植支架种类较多，按材料可分为天然生物支架材料、人工合成支架材料和复合型支架材料3大类。

　　2.1 天然生物支架材料

　　用于脊髓细胞移植支架的天然生物支架材料主要分为蛋白质和多糖2类。该类材料最大优点是生物相容性好,降解产物易于被吸收而不产生炎症反应,但存在力学性能差,尤其是力学强度与降解性能间存在反对应关系,即高强度源于高分子量,导致降解速度慢,难于满足组织构建的速度要求,也使构建多孔三维支架存在困难，并受到分离、提取过程中不同批号之间质量难以控制的影响。

　　2.2 人工合成支架材料

　　包括不可降解的非生物材料如尼龙、硅胶管、聚氨酯，可降解聚合物主要有聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚体等。可降解性合成高分子材料是目前组织工程用生物材料的主要研究对象，这类材料降解速度和强度可调,容易塑型和构建高孔隙度三维支架,其主要缺陷在于降解产物容易产生炎症反应,降解单体集中释放,会使培养环境酸度过高，对宿主组织和种子细胞可能具有不良影响，材料表面也容易残留对细胞有毒性作用的有机溶剂等。另外,可降解性合成高分子材料对细胞亲和力弱,需要进行表面修饰才能更好地黏附细胞和复合营养因子。

　　2.3 复合型支架材料

　　复合型支架材料可以由天然可降解生物材料之间混合而成，如胶原-壳聚糖、明胶-壳聚糖、胶原-硫酸软骨素等，也可以由人工合成的材料混合如聚乙烯醇-壳聚糖、透明质酸-戊二醛等。复合材料制成的支架在兼顾其它优良功能而改变复合物比例时,其韧性和硬性等机械性能和同质性可能变低,不利于支架对负荷的承受。

　　3 纳米支架材料的生物学特征及其构建

　　3.1 纳米支架材料的生物学特征

　　细胞在体内生存的微环境大多是由66 nm 胶原纤维构成的纳米支架结构，纳米级的支架结构界面可能是调节细胞生命活动的一个重要因素。纳米材料有小尺寸效应和表面或界面效应，使其一些物理性质因不连续的能级间歇而表现出异常，而表面原子处于不饱和状态，表面能大大增加，具有很大的活性，易与其它原子相结合而稳定下来。支架材料的孔为细胞提供了生长空间，因此孔的性能(如孔尺寸、孔隙率等) 都对支架的性能有重要影响。

　　纳米纤维，其连续性的构造更适合作为支架材料的组成结构。纳米纤维材料仿生化的微环境能影响细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，调节细胞的生物学行为[3]。与传统的支架材料相比较，纳米支架的优点有：(1)无免疫原性，生物相容性好;(2)高孔隙率，可调节的孔径分布，孔隙率达90%以上，为细胞和组织的生长提供足够的空间和营养代谢环境;(3)良好的生物降解性能、可塑性和适宜的力学性能;(4)高表面积体积比，良好的材料-细胞界面，利于细胞黏附、生长和繁殖;(5)天然细胞外基质( extracellular matrix,ECM)相似的形态结构[4～6]。

　　3.2 纳米支架材料的制备方法

　　目前制备纳米纤维支架的方法很多，如相分离、自组装、电子纺丝等。由于电子纺丝技术制备方法相对简单，并且随着纳米技术的兴起，这种技术逐渐成为组织工程支架材料制备较为流行的方法。大多数ECM都是由随机定向的纳米级胶原组成的，电纺纤维的形态结构与天然ECM 很相似。经电子纺丝技术制备的纳米纤维支架有高达90%的孔隙率，孔径范围高至100μm，并且有可变的尺寸和形状[3]。

　　Li等[4]在高压电场下制成一种直径500～ 800 nm的乙交酯/丙交酯共聚物(polylatic-glycolic acid copolymer,PLGA ) 超微纤维的高度多孔支架， 其孔隙率达90% 以上，力学性能良好，形态类似于活组织的ECM，除了能显著提高细胞的黏附性能和增殖能力，还能很好地保持细胞的形态并引导细胞按纤维方向定向生长。他认为制备的细胞支架与ECM 结构类似,有利于细胞黏附和增殖,并有好的生物相容性，达到了细胞支架的设计要求。

　　Yang[7]等曾经用液-液相分离的方法制备左旋聚乳酸(PLLA) 纳米纤维，但难以控制纤维直径和取向，因而不适用于神经细胞支架。目前他们利用静电纺丝法，调整聚合物分子量、纺丝液流速、电场等控制纤维直径，滚筒收集速度为1 000 r/min时可获得有序排列的纤维。

　　4 纳米支架材料在脊髓组织工程中的实验研究

　　在组织工程材料的合成与制备中，越来越多的学者采用纳米技术对生物材料表面改建或者直接采用纳米材料或纳米复合材料作为细胞移植的支架。

　　Yang[7]等利用静电纺丝法形成由纳米、微米级左旋聚乳酸纤维并以有序、无序排列形成的4种支架，首次培养神经干细胞，探索其在神经修复中的应用。应用激光扫描共聚焦显微镜观察，Yang等发现神经细胞和轴突沿纤维取向伸展和生长，与微米级纤维支架相比，细胞在纳米级纤维上的分化率更高，在平行纤维上有助于轴突生长，表明静电纺纳米纤维支架在神经修复中具有重要的应用价值。

　　MIT小组[8]利用水凝胶开发了一种用于神经细胞培养的支架材料—纳米多肽纤维支架溶液，溶液里的多肽如同微型的蜂巢，当注入动物的神经细胞时，溶液在受伤的裂缝之间流动，然后这些分子在几个神经元之间把裂缝连接在一起形成支架，细胞在支架上面增殖。这种支架为神经细胞提供了一个良好的环境，不仅可以使受伤的细胞准确地再生，而且还可以把脑神经组织联系起来，是一种很好的神经组织工程的支架材料。

　　TysselingMattiace[9]等认为含有IKVAV多肽的IKVAV两亲性分子(IKVAVPA)纳米纤维可抑制体外培养神经干细胞的胶质细胞分化，并可以促进体外培养神经元的轴突生长。他们通过注入一种液体在脊髓细胞外空间内形成纳米级的结构，因为这些分子的自组装是由活体环境中的离子强度而激发的。实验表明，脊髓损伤后活体用IKVAVPA治疗，在损伤区域减少了胶质化，减少了细胞死亡，增加了少突胶质细胞的数量。此外，这些纳米纤维还促进了通过损伤区域的下行运动纤维和上行感觉纤维的再生，也可带来明显的动作能力提高。这些观察表明：脊髓损伤后使用生物活性三维纳米结构可以抑制胶质细胞瘢痕的形成，也可以促进其再生。

　　Thid D[11]等发现在不同的多肽浓度下(0～10%)，细胞附着和IKVAV浓度之间呈现出非常强的非线性关系。当使用杂乱的多肽序列时，细胞附着减少了10倍，这些都证明了IKVAV和神经前体细胞细胞表面受体之间特异性的相互作用。

　　邹枕玮[12]等认为含IKVAV 活性位点的多肽自组装材料对神经细胞有良好的细胞相容性，能诱导轴突的发生和延长，具有支架及生物活性双重作用，可作为一种新型的组织工程材料。该二维凝胶支架能诱导神经元轴突的发生和延长，且能延长神经元在体外的存活时间，有神经营养作用，其作用机制可能是通过IKVAV与神经细胞表面的LBP110结合后通过信号传导上调细胞内cfos基因的表达，从而促进细胞的生长和轴突的延长[13]。Silva GA[14]认为带有IKVAV多肽片断的分子通过自组装可以形成一种具有高密度IKVAV表位的纳米纤维水凝胶支架，在这种纳米纤维支架中生长的鼠神经前体细胞的神经元生长速度明显快于对照材料。

　　Guo J[15]认为在外伤性脊髓损伤中，由于形成大的囊性空洞，损害轴突的失能导致神经功能的丧失。近来研究证明自组装纳米纤维支架(SAPNS)能够修复光学通路和视觉功能。为了证明用它修复脊髓损伤的可能，在SAPNS中培养神经前体细胞和雪旺氏细胞，然后移植到横断脊髓背侧束的大鼠体内，结果在支架内有细胞的迁入、血管和轴突的增生，表明用SAPNS能够桥接损伤的大鼠脊髓，为活体细胞的迁移提供了一个真正的三维环境。

　　2007年4月23日，美国西北大学纳米生物医学研究所的Stupp等在华盛顿召开的Project on Emerging Nanotechnologies会议上报告，脊髓损伤致瘫痪的小鼠，在注射了含生物活性的纳米纤维后6周，开始恢复行走功能。Stupp认为脊髓损伤时星形胶质细胞在损伤处聚集形成瘢痕，神经细胞轴突无法在损伤处生长，从而使神经无法修复。层粘连蛋白(laminin)是大脑发育中起重要作用的蛋白质，分布在细胞外，含神经细胞突起抗原决定簇(neurite sprouting/guiding epitope) 。研究人员设计了有生物活性的纳米纤维，含层粘连蛋白和神经干细胞，注射入小鼠体内后，神经细胞突起抗原决定簇可以与调整细胞分化的整合素结合，启动信号转导通路，刺激神经轴突延长。24 h后，神经干细胞开始在损伤处分化，产生新的神经元细胞，这可以抑制胶质细胞形成瘢痕，帮助神经修复，8周后纳米纤维通过生物途径降解。Stupp教授介绍，实验中小鼠的脊髓损伤程度相当于人体中非常严重的损伤，例如滑雪和车祸造成的。他们已经开始向美国FDA申请Ⅰ期临床试验(关于毒性和安全性)，在人体脊髓损伤后的1 d内注射该纳米纤维。

　　5 纳米支架材料应用的研究展望

　　纳米级支架材料所展示出的优异特性，使其在组织工程领域具有十分诱人的应用前景。随着纳米技术的成熟，制备工艺的优化，基因工程的引入，纳米材料安全性能的科学评价等将是纳米级组织工程支架材料未来临床应用的挑战。

【参考文献】
  　　[1] Desia TA.Micro and nanoscale structure for tissue engineering constructs[J].Med Eng Phys,2002，2:595-606.

　　[2] 郭树章,任先军,蒋　涛,等.脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察 [J].中国矫形外科杂志，2007,3:226-228.

　　[3] Christenson EM,Anseth KS,van den Beucken JJ,et al.Nanobiomaterial applications in orthopedics[J].Orthop Res,2007,1:11-22.

　　[4] Li WJ,Laurencin CT,Caterson EJ,et al.Electrospun nanofibrousstructure:a novel scaffold for tissue engineering[J].Biomed Mater Res,2002,4:613-621.

　　[5] Li WJ,Tuli R,Huang X,et al.Multilineage differentiation of human mesenchymal stem cells in a three-dimensional scaffold[J].Biometerials,2005,25:5158-5166.

　　[6] Shin M,Yoshimoto H,Vacanti JP.In vivo bone tissue engineering using mesenchymal stem cells on a novel electrospun nanofibrous scaffold[J].Tissue Eng,2004,1-2:33-41.

　　[7] Yang F,Murugan R,Wang S.Electrospinning of nano/micro scale poly( Llactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering[J].Biomaterials,2005,26:2603-2610.

　　[8] EllisBehnke RG,Liang YX,You SW,et al.Selfassembled peptide nanostructures:the design of molecular building blocks and their technological utilization[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,13:5054-5059.

　　[9] TysselingMattiace VM,Sahni V,Niece KL,et al.Selfassembling nanofibers inhibit glial scar formation and promote axon elongation after spinal cord injury[J].Neurosci,2008,14:3814-3823.

　　[10]Santiago LY,Nowak RW,Peter Rubin J,et al.Peptidesurface modification of poly(caprolactone) with lamininderived sequences for adiposederived stem cell applications[J].Biomaterials,2006,15:2962-2969.

　　[11]Thid D,Holm K,Eriksson PS,et al.Supported phospholipid bilayers as a platform for neural progenitor cell culture[J].Biomed Mater Res,2008,4:940-53.

　　[12]邹枕玮,郑启新,吴永超,等.自组装IKVAV 多肽纳米支架及其对背根神经节神经元细胞的作用[J].中国脊柱脊髓杂志，2007,6:450-453.

　　[13]Kasai S,Ohga Y,Mochizuki M,et al.Multifunctional peptide fibrils for biomedical materials[J].Biopolymers,2004,1:27-33.

　　[14]Silva GA,Czeisler C,Niece KL,et al.Selective differentiation of neural progenitor cells by highepitope density nanofibers[J].Science,2004,303:1352-1355.

　　[15]Guo J,Su H,Zeng Y,et al.Reknitting the injured spinal cord by selfassembling peptide nanofiber scaffold[J].Nanomedicine，2007，4:311-321.

作者单位：南通大学第二附属医院，江苏 南通 226001