丙泊酚对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏的影响

【摘要】  目的 观察丙泊酚单次静脉给药对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏的影响，探讨丙泊酚循环抑制机制。方法 选择拟全麻下行择期手术治疗的老年患者30例，随机分为3组(n=10)。低剂量组(L组)：丙泊酚1.0 mg/kg，高剂量组(H组)：丙泊酚2.0 mg/kg，对照组(C组)：生理盐水。全麻诱导前，静脉单次注药。给药前后3 min，记录SBP、DBP和HR变化，同时抽取外周静脉抗凝血各15 mL，Boyum法分离淋巴细胞，免疫印迹法分别检测总蛋白、胞膜和胞浆蛋白中的β1肾上腺素能受体表达，放免法检测异丙肾上腺素刺激的淋巴细胞内cAMP含量。结果 与C组比较，L组和H组给药后均可引起SBP、DBP、淋巴细胞内cAMP含量及胞膜β1肾上腺素能受体蛋白水平降低(P<0.05或P<0.01)，胞浆β1肾上腺素能受体蛋白水平增加(P<0.05或P<0.01);与L组比较，H组的指标变化明显(P<0.05)。组间两两比较，淋巴细胞总蛋白中β1肾上腺素能受体水平变化均无显著差别(P>0.05)。结论 丙泊酚单次静脉给药可引起老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏，且呈剂量依赖性，与促进β1肾上腺素能受体由胞膜内化进入胞浆有关;β1肾上腺素能受体脱敏可能是丙泊酚的循环抑制机制之一。

【关键词】  丙泊酚;外周血淋巴细胞;β1肾上腺素能受体;脱敏;免疫印迹

　Abstract: Objective To evaluate the effect of propofol on the desensitization of peripheral lymphocytic β1 adrenergic receptor (β1AR) in eldly patients. Methods Thirty eldly patients were recruited and classified into three groups (n=10): low dose group (group L), high dose group (group H) and control group (group C). 1.0 mg/kg propofol was given to group L, 2.0 mg/kg propofol was given to group H and normal saline was given to group C through intravenous injection. The systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP) and heart rate (HR) before and after injection were recorded. The lymphocytes were isolated. The expressions of β1AR in total protein, cytomembrane and cytoplasm were detected by western blot respectively. Isoproterenolstimulated cAMP products in lymphocytes were measured by radioimmunoassay. Results SBP,DBP,cAMP product and β1AR level in lymphocytic cytomembrane in group L and group H were lower than those in group C (P<0.05). On the contrary, β1AR protein level in lymphocytic cytoplasm in group L and group H was significantly higher than that in group C (P<0.05). No significant differences in β1AR level in total protein was detected between the three groups(P>0.05). Conclusion Intravenous injection of propofol to elderly patients can induce the desensitization of peripheral lymphocytic β1AR in a dosedependent manner. β1adrenergic signal transduction in peripheral lymphocyte was decreased through internalizing β1AR into cytoplasm and inhibiting cAMP production, which could be a contributory factor of cardiac vascular inhibition.

　　Keywords: propofol;peripheral lymphocyte; β1 adrenergic receptor; desensitization; western blot

　　丙泊酚对老年患者的心血管抑制效应明显，其机制目前尚不明确。研究表明，β肾上腺素能受体(βAR)脱敏可引起心肌兴奋收缩脱偶联，降低心肌收缩力。人类外周血淋巴细胞和心肌细胞βAR反应性相平行[1]。本研究通过观察丙泊酚对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体(β1AR)脱敏的影响，探讨其循环抑制机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　选择拟全麻下行择期手术治疗的老年患者30例，年龄65～78岁(平均70.2岁)，ASAⅠ～Ⅱ级，随机分为3组(n=10)，每组男、女各5例。低剂量组(L组)：丙泊酚1.0 mg/kg。高剂量组(H组)：丙泊酚2.0 mg/kg。对照组(C组)：生理盐水0.25 mL/kg。排除合并心血管系统疾病、糖尿病及甲状腺功能异常患者。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　丙泊酚(AstraZeneca S.P.A.);人淋巴细胞分离液、3异丁基1甲基黄嘌呤(Sigma公司);异丙肾上腺素注射液;125IcAMP放免试剂盒(上海中医药大学核医学实验室);胞核胞浆胞膜制备试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);RIPA细胞裂解液(强)(上海碧云天生物技术有限公司);兔抗人β1AR多克隆抗体、小鼠抗人βactin单克隆抗体及HRP标记的羊抗兔(鼠)IgG(美国Santa Cruz公司);ECM显色剂(武汉博士德生物工程有限公司)。SN697型γ计数仪;垂直凝胶电泳系统及湿转仪(BIORAD公司);PVDF膜(Millipore公司)。

　　1.3 外周血淋巴细胞分离

　　入室后开放静脉，监测BP、ECG、SpO2，面罩供氧，循环稳定后注射丙泊酚或生理盐水，丙泊酚输药速度每10 s大约3 mL(30 mg)。给药前后3 min，各抽取静脉肝素抗凝血15 mL，Boyum法分离淋巴细胞(参照人淋巴细胞分离液使用说明)。1×PBS液调整细胞浓度为5×106 /mL，经Gimsa Wright和Trypan blue染色鉴定，淋巴细胞纯度大于90%，活力大于98%。本过程均于采血后1 h内完成。

　　1.4 放免法测定淋巴细胞cAMP含量

　　取淋巴细胞悬液500 μl，加入1 mmol/L异丙肾上腺素10 μl，用结合缓冲液(1 mmol/L 3异丁基1甲基黄嘌呤)将反应体系调至600 μl，孵育12 min(37 ℃)，煮沸5 min终止反应，离心(800 g×15 min)，取上清液100 μl，放免法测定各样本的cAMP含量(参照125IcAMP放免试剂盒使用说明)。

　　1.5 Western blot法测定β1AR蛋白表达

　　每个淋巴细胞悬液样品取0.5 mL及2.0 mL各一份，离心(800 g ×5 min)，弃上清，采用RIPA(强)裂解液(含1 mmol/L PMSF)制备总蛋白，胞核胞浆胞膜制备试剂盒差速离心法制备胞膜粗成份及胞浆蛋白(具体操作参照产品说明书)。所得胞膜粗成份加入适量RIPA裂解液，继续提取胞膜蛋白。BCA法测定蛋白含量。取蛋白样品各50 μg，按体积比4∶1加入5×SDS蛋白上样缓冲液(含DTT)，100 ℃煮沸5 min，冷却至室温后和预染的低分子量蛋白质Marker分别上样。经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶70 V，分离胶120 V)，恒压110 V×2.5 h转膜，丽春红染色后进行免疫检测。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，与一抗(兔抗人β1AR多克隆抗体，1∶300;鼠抗人βactin单克隆抗体，1∶3 000)孵育过夜，二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，1∶3 000;HRP标记的羊抗小鼠IgG，1∶5 000)室温孵育50 min，经含0.05% Tween20的Tris碱缓冲液洗膜(3×10 min)后，ECL显色3 min，暗室中压片2 min，显影、定影各1 min。FluorS图像分析系统对区带进行扫描，含量以平均吸光度A乘以面积表示。产物半定量以β1AR和βactin间的比值计算。

　　1.6 统计学处理

　　数据采用SPSS 11.5统计软件分析处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组内比较用配对t检验，组间比较用单因素方差分析SNKq检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 外周血淋巴细胞cAMP含量变化

　　丙泊酚对外周血淋巴细胞内cAMP含量的影响见表1。与C比较，L组和H组给药后异丙肾上腺素刺激的淋巴细胞内cAMP含量均不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。与L组比较，H组cAMP降低幅度明显(P<0.05)。表1 淋巴细胞内cAMP含量变化

　　2.2 丙泊酚对老年患者血流动力学的影响

　　与C比较，L组和H组给药后SBP、DBP均显著降低(P<0.05或P<0.01)，HR轻度降低但差别无统计学意义(P>0.05)。与L组比较，H组SBP、DBP降低幅度明显(P<0.05),见表2。表2 不同剂量丙泊酚对血流动力学的影响比较

　　2.3 外周血淋巴细胞β1AR蛋白水平的变化

　　Western blot法分别检测老年患者外周血淋巴细胞β1AR蛋白和内参βactin蛋白表达，结果显示65 kDa和43 kDa的特异信号产物(图1)。外周血淋巴细胞胞膜、胞浆和总蛋白中β1AR蛋白水平变化见图2。与C组比较，L组和H组给药后淋巴细胞胞膜的β1AR蛋白水平均不同程度降低(P<0.05)，胞浆的β1AR蛋白水平均不同程度增加(P<0.05);与L组比较，H组的变化幅度明显(P<0.05);组间两两比较，淋巴细胞总蛋白中β1AR蛋白水平变化均无显著差别(P>0.05)。C：对照组;L：低剂量组;H：高剂量组;mp：膜蛋白;cp：胞浆蛋白;tp：总蛋白图1 Western blot法检测外周血淋巴细胞β1AR蛋白表达*：与C组比较，P<0.05;#：与C组比较，P<0.01;▲：与L组比较，P<0.05;mp：膜蛋白;cp：胞浆蛋白;tp：总蛋白图2 丙泊酚对外周血淋巴细胞β1AR水平的影响

　　3 讨论

　　丙泊酚是临床麻醉中常用的静脉麻醉药，用于成人全麻诱导推荐剂量为1.5～2.5 mg/kg，老年患者所需用药量一般有所下降。丙泊酚在组织内分布半衰期为2～4 min。故本研究采用1.0 mg/kg和2.0 mg/kg两种剂量，并于输药前后3 min检测相关指标。本研究结果表明，所用两种剂量丙泊酚单次静脉注射，均可引起老年患者循环抑制，异丙肾上腺素刺激的外周血淋巴细胞内cAMP产量降低，淋巴细胞胞膜β1AR蛋白水平降低和胞浆β1AR蛋白水平增加;高剂量组上述指标变化更为明显。所用两种剂量均不影响淋巴细胞总蛋白中β1AR水平。

　　β1AR下调或与G蛋白的结合受阻均可降低受体对儿茶酚胺的敏感性，减少细胞内cAMP产量，出现脱敏现象[2]。动物研究表明，异丙酚静脉给药可引起大鼠心肌βAR下调，其程度与剂量有关[3]。本研究结果与上述报道相似，且进一步证实临床剂量的丙泊酚单次给药，导致外周血淋巴细胞β1AR下调，主要与改变受体在胞膜和胞浆中的分布有关，而不影响β1AR蛋白总体表达水平。丙泊酚是否影响β1AR与G蛋白的结合有待进一步研究。丙泊酚下调β1AR的机制尚不明确，可能与抑制中枢及外周的交感神经活性有关。有文献报道，丙泊酚可降低交感神经系统神经肽Y及去甲肾上腺素分泌[4]。β1AR下调所导致的心血管系统的低反应性，部分解释了丙泊酚降低血压但却不伴随反射性心率增快，甚至轻度减慢心率的原因。细胞内cAMP含量依赖于儿茶酚胺与β1AR结合激活Gαs，从而活化AC。β1AR脱敏，ACcAMPPKC信号转导通路受阻，影响L型钙通道磷酸化程度及钙离子内流[5]，可能是丙泊酚抑制心肌收缩力的重要作用机制。

　　目前多数研究采用放射配基受体结合分析法测定心肌细胞表面βAR密度。放射性物质需要特殊防护措施且具有潜在的放射污染，实验应用受到一定限制。心肌标本取材困难，临床研究同样受到限制。与心肌细胞相似，淋巴细胞表面同样存在β1、β2和β3三种βAR亚型分布[6]。本研究采用密度梯度离心法分离淋巴细胞组份，Western blot法分别检测β1AR表达，结果表明丙泊酚对淋巴细胞胞膜中β1AR分布及胞浆中cAMP产量变化与给药剂量有关，与SBP、DBP变化趋势相同,提示外周血淋巴细胞可作为有效模型，间接反应麻醉药物对心肌β1AR系统的影响。

　　总之，本研究表明，丙泊酚单次静脉给药可引起老年患者外周血淋巴细胞β1AR脱敏，呈剂量依赖性，与促进β1AR由胞膜内化进入胞浆有关，但不改变β1AR蛋白表达水平。

【参考文献】
  　[1] Tilley DG, Rockman HA. Role of betaadrenergic receptor signaling and desensitization in heart failure: new concepts and prospects for treatment[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2006,4(3):417-432.

　　[2] 冯作化.医学分子生物学[M].北京：人民卫生出版社，2005.131-133.

　　[3] 黄雄庆，陈秉学，卢汉平，等.异丙酚对大鼠心肌β受体的影响[J].中华麻醉学杂志，1998,18(12):741-743.

　　[4] Uchida M, Iida H, Osawa Y, et al. Clonidine attenuates the hemodynamic responses to hypercapnia during propofol anesthesia [J]. Can J Anaesth, 2004,51(2):188-189.

　　[5] Wickley PJ, Shiga T, Murray PA, et al. Propofol decreases myofilament Ca2+ sensitivity via a protein kinase C, nitric oxide synthasedependent pathway in diabetic cardiomyocytes[J]. Anesthesiology, 2006,104(5):978-987.

　　[6] Yu XY, Lin SG, Wang XM, et al. Evidence for coexistence of three betaadrenoceptor subtypes in human peripheral lymphocytes[J]. Clin Pharmacol Ther, 2007,81(5):654-658.