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【摘要】 目的 筛选一种新的具有良好组织/细胞相容性、降解时间适合、没有毒性和/或炎症反应的组织工程心脏瓣膜支架材料。方法 扫描电镜观察材料的微观结构;将胶原-透明质酸钠复合膜在无菌术下包埋于兔皮下，分别于2、4、6、8、12、14周取出通过大体和HE观察膜片的降解程度和组织反应;取犬大隐静脉分离培养内皮细胞和间质细胞并经免疫组化方法鉴定，选增生活跃的细胞分别种植于膜片上，先后3次共培养7天，倒置显微镜和HE切片光镜观察。结果 胶原-透明质酸钠复合膜呈蜂窝海绵样，孔径大小为（112±9）μm。兔皮下包埋实验显示，材料组织相容性好，完全降解时间为12～14周。细胞种植实验显示两种细胞均覆盖于材料表面且间质细胞长入了材料孔隙内。结论 大隐静脉内皮细胞和间质细胞是较理想的种子细胞;胶原-透明脂酸钠复合膜有良好的组织/细胞相容性、适合的降解时间和孔隙结构，初步认为是一种可用于组织工程心脏瓣膜支架的生物材料。
关键词 组织工程心脏瓣膜 支架材料 胶原-透明脂酸钠复合膜 组织/细胞相容性
Histo/cell-compatibility of collagen-sodium hyaluronate acid（C-SHA）
composite membrane as matrix of tissue engineering of heart valve
Liu Xingguang，Wang Gang，Yu Shiqiang，et al.
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi’an710032.
【Abstract】 Objective To filtrate a kind of promising matrix materials of tissue engineering of heart valve that have good Histo/cell-compatibility and appropriate degradation time and no toxic degradation and/or inflammatory reactions.Methods Microstructures were observed by scanning electron microscopy（SEM）;C-SHA composite membrane was implanted subcutaneously in rabbits in sterile conditions and extirpated at2，4，6，8，12，14weeks reˉspectively to study its biodeg
radability and histocompatibility by general and HE;Endothelial cells（ECs）and interstiˉtial cells（ICs）were isolated and cultivated from explanted canine saphenous vein and characterized by immunohistoˉchemistry，then seeded activated cells on C-SHA membrane3times totally in7days respectively and observed by inverted microscop and HE.Results The C-SHA membrane like a honeycomb sponge，and its porosity demonstratˉed>90%，pore sizes was（112±9）μm.It had good histocompatibility and12～14weeks of degradation time.Inˉverted microscop and HE showed2kinds of cells covered on the C-SHA membrane，and ICs grew into pores.Conˉclusion This study demonstrates preliminary that ECs and ICs of canine saphenous vein can be easily obtained cliniˉcally as an alternative cell source;C-SHA membrane is a suitable biodegradable scaffold as matrix of tissue engiˉneering of heart valve that have good Histo/cell-compatibility and appropriate degradation time and microstructures.
Key words tissue engineering of heart valve matrix materials collagen-sodium hyaluronate acid composite membrane histo/cell-compatibility
心脏瓣膜置换是心脏外科治疗严重瓣膜病的即定方法，常用的瓣膜替代物有机械瓣、生物瓣和同种瓣三种。这些瓣膜功能良好但也有其固有的不足。始于上世纪90年代中期的组织工程心脏瓣膜利用组织工程学原理和技术，将自体细胞种植在可降解支架材料上培育出的自体心脏瓣膜，具有良好的组织相容性、无免疫原性、耐久性好、不需终生抗凝，而且具有生物活性，能为生长期患儿提供潜在的生长能力，并可修复累加的创伤 ［1］ 。在组织工程研究中，寻找能充分发挥组织再生潜力的仿生型细胞外基质-支架材料是重要内容和难点之一。支架材料主要承担瓣膜力学构型和细胞粘附载体的作用，种子细胞种植在支架上黏附、增殖和分泌胞外基质（ECMs）进行组织塑形，同时支架逐渐降解。它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好的适应、结合、修复和替代，是限制组织工程能否真正应用于临床的一个关键因素。笔者研究胶原-透明质酸钠复合膜的微观结构、组织/细胞相容性和降解时间，对其在组织工程心脏瓣膜的应用进行评价和展望。
1 材料与方法
1.1 材料 胶原-透明质酸钠复合膜由中国医学科学院生物工程研究所张其清教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 材料的微观结构观察 材料用2.5%戊二醛固定、乙腈梯度脱水、喷金后用扫描电子显微镜（S-520HITACHI，Japan）观察。同时材料常规石蜡包埋行HE染色普通光镜观察。
1.2.2 皮下包埋-材料组织相容性实验 参考汪钢、张其清等 ［2］ 的方法，将材料制备成1.0cm×1.0cm大小， 60 Co12000Gy照射消毒备用。新西兰大白兔以846合剂0.2ml/kg肌肉注射麻醉，取俯卧位固定于手术台上。背部两侧备皮，软皂水刷洗，无菌生理盐水冲洗，碘伏消毒，铺巾。在兔背胸腰段脊柱两侧各做3个切口，钝性分离皮下组织，形成皮下腔隙。每只兔对称植入各2片共6片材料，横向间距4cm，纵向间距4cm。缝合后无压力包扎，饲养。分别于术后2、4、6、8、12、14周取出，行HE普通光镜观察。
1.2.3 犬大隐静脉内皮细胞的培养和鉴定 846合剂0.2 ml/kg体重肌注麻醉成年杂种犬，无菌术下取大隐静脉10～15cm放入预冷的PBS液中。剥除血管外膜的结缔组织，结扎分支后放入培养皿中，PBS冲洗3次。从静脉的一端插入静脉留置针，结扎固定，然后用丝线将另一端结扎。通过静脉留置针向血管内注入1000U/L的胶原酶，至血管充盈为止。置入37℃孵育箱中消化15min后收集消化液，再用10ml DMEM液冲洗管腔。将消化液和冲洗液离心10min（1000r/min）。吸去上清液，用DMEM培养液混悬沉淀细胞。将细胞接种在50ml培养瓶中，加5ml含20%新生小牛血清的DMEM液，放入37℃5%CO 2 孵育箱中培养。每隔2～3天换液1次。待细胞汇合后，传代培养。VIII因子抗体进行鉴定。
1.2.4 犬大隐静脉间质细胞的培养和鉴定 材料来源为消化内皮细胞后的同一根犬大隐静脉。采用植块培养法。新鲜PBS液血管腔内外冲洗3次;置干燥培养皿中，滴加少许DMEM培养液使组织保持湿润，用眼科剪剪绞血管成糊状;向培养皿中加5ml无血清DMEM培养液，反复吹打;置入离心管中1500r/min离心5min后弃上清液;接种于25ml培养瓶，间距0.5cm，20～30块，加少量含20%新生小牛血清的DMEM液（24h后再添加至全量5ml）放入37℃、5%CO 2 孵育箱中培养;每隔2～3天换液1次。待细胞生长形成单层时，传代培养，a-SMA鉴定。
1.2.5 细胞种植 将材料制成1.0cm×1.0cm大小各6片共12片，分两组置入48孔培养板中，一组种内皮细胞，另一组种间质细胞。 60 Co12000Gy照射消毒后在37℃、5%CO 2 孵育箱中用DMEM浸泡48h，新生小牛血清浸泡12h。取3～5代生长状态良好的内皮细胞，0.25%胰酶消化成细胞悬液，以2×10 5 /孔接种于支架材料上，加含20%新生小牛血清的DMEM液，放入37℃、5%CO 2 孵育箱中培养。第3天、第5天间隔48h换液时再以相同细胞数接种2次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状态1～2次。第8天取出材料行HE切片光镜观察。间质细胞种植同内皮细胞。
2 结果
2.1 材料显微结构 胶原-透明质酸钠复合膜外观呈乳白色，质地柔软有一定韧性和拉伸度。HE染色呈均匀红染，疏松纤维网孔状结构。扫描电镜显示C-SHA复合膜孔隙形状均为圆形或椭圆状相互交通呈蜂窝海绵样，孔隙率>90%，孔径大小为（112±9）μm。
2.2 材料组织相容性 （1）大体观察:2周组材料体外可触及，轮廓清楚，纤维包膜较薄，疏松易与材料分离。4周组材料体外仍可触及，纤维包膜略增厚，剥离后可见纤维结缔组织与材料结合紧密但仍易分离。6、8周组纤维包膜变薄，与材料结合紧密，材料仍呈膜片状，表面的细孔明显扩大，呈洞状降解吸收现象。12周组材料大部吸收，材料变得极薄，和纤维结缔组织融为一体。14周组材料已完全吸收。各组材料无血管增生、脓肿、坏死等现象。（2）组织细胞学观察:2、4周组包膜纤维结缔组织疏松，有少量成纤维细胞增生，伴较多中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞。6、8周组材料进一步被纤维结缔组织取代，以淋巴细胞浸润为著。12周组材料大部为纤维结缔组织，炎细胞几乎消失。14周组材料完全吸收，被均一红染的纤维结缔组织代替，无炎细胞。各组均未见组织变性、坏死。
2.3 内皮细胞培养和鉴定 原代犬大隐静脉内皮细胞（EC）种入培养瓶中5～6h后即开始贴壁、伸展，细胞初始状态多为圆形，伸展后呈短梭形，核呈圆形或长圆形，有1个至数个核仁，可见多个核分裂像。细胞呈集落生长，48h换液后生长加快。第4天细胞集落开始汇合，细胞呈多角形，第5天EC完全汇合呈特征性的铺路鹅卵石样形态，细胞排列紧密，胞浆丰富。此时开始传代培养。Ⅷ因子相关抗原抗体染色在倒置显微镜下呈强阳性表达，核周胞浆区呈明亮黄褐色。
2.4 间质细胞培养和鉴定 组织块植入培养瓶中12h后见长梭形的细胞贴壁围绕于植块周围，第3天细胞70%已汇合，取出植块并换液后细胞增生活跃，第5天已完全汇合，呈长梭形和不规则形，细胞排列紧密，胞浆丰富。此时开始传代培养。a-SMA免疫组化染色大部细胞呈阳性表现，核周胞浆区呈明亮黄褐色。
2.5 细胞种植 内皮细胞和间质细胞分别种植于材料上，均在6～8h后贴壁，48h后见贴壁细胞分布不均，没能完全覆盖材料表面。经第2、第3次接种后，细胞完全覆盖材料表面，细胞形态分别同2.3和2.4所描述，无变化。HE染色切片显示两种细胞均覆盖于材料表面且间质细胞长入了材料孔隙内。
3 讨论
3.1 支架材料的筛选是组织工程的上游问题 目前主要采用3类支架材料，去细胞生物瓣（同种或异种），如猪主动脉瓣或人肺动脉瓣等;天然材料，如明胶、胶原、弹力蛋白、壳聚糖、纤维蛋白凝胶等;可降解型高分子材料:如PLA、PGA、PLGA、PHB、PHO、PHA等。但它们仍有不少缺点 ［3］ ，基于这些原因，研究人员在积极寻找其它类型的支架材料。当前，复合杂化新型的支架材料是一新的研究热点，因它集两种或两种以上材料的优点而能更好满足不同组织工程的要求。本实验中C-SHA复合膜正是基于这一期望制备的。透明质酸Hyaluronic acid，HA）广泛存在于动物组织细胞间质中，商品HA一般为其钠盐，即透明质酸钠（Sodium hyaluronate acid，SHA），广泛存在于人体结缔组织细胞外基质中的一种多糖类物质，是由葡萄糖醛酸和乙酰基葡萄糖交替排列构成的长链分子，为酸性粘多糖。它具有保湿性、润滑性、生物相容性、生物可降解性、细胞附着等功能，目前开发应用于新型药物缓释基质、抗凝抗栓复合材料、软组织填充材料、防疤痕美容材料、组织工程支架材料。最近Y.Dausse ［4］ 用SHA和藻酸盐的共混物作为软骨组织工程支架，发现该共混物有良好的可降解性和细胞亲和力。胶原是由动物细胞合成的一种生物高分子，是人和脊椎动物体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，它的抗原性低，有良好的生物相容性和可降解性，是最早被使用的生物材料之一。国内汪钢、赵东锷等 ［2］ 研究认为以胶原膜为支架构建组织工程心脏瓣膜是可行的，但其组织/细胞相容性尚待进一步改进。
3.2 组织工程支架材料要有良好的结构相容性 ［5］ 能保持稳定的三维立体结构，海绵状或纤维网状三维支架具有互相连通的孔结构与高达90%以上的孔隙率，孔径大小适当，可以为种子细胞均匀分布和生长提供足够的空间，同时也有利于营养物质和代谢产物的扩散。胶原-透明质酸钠复合膜的孔径大小为（112±9）μm，孔隙率>90%，间质细胞可以很好的长入材料，说明它符合组织工程心脏瓣膜支架材料的要求。
3.3 组织工程支架材料要有良好的组织相容性和适度的生物降解率 ［5］ 其本身或降解产物不会引起炎症和免疫排斥反应;降解率需和组织再生率相匹配，最后可完全吸收或安全地排出体外。皮下包埋实验显示12周组材料大部为纤维结缔组织代替，炎细胞几乎消失。14周组材料完全吸收，无炎细胞浸润。各组均未见组织变性、坏死。Sodian ［6］ 和Stock ［7］ 认为瓣膜支架的降解时间不宜短于8周、长于52周。胶原-透明质酸钠复合膜的吸收时间为12～14周，降解产物为CO 2 和H 2 O，认为它符合组织工程心脏瓣膜支架材料的要求。
3.4 组织工程支架材料要有良好的细胞相容性 即良好的材料-细胞界面 ［5］ 利于细胞粘附、生长种植实验显示两种细胞均覆盖于材料表面且间质细胞长入了材料孔隙内。 原因可能为胶原和透明质酸钠均为正常组织的胞外基质，有较好的组织相容性，而且在其表面有一些细胞结合位点和氨基酸序列，从而使其具有较好的细胞相容性。
大隐静脉内皮细胞和间质细胞取材简易，在体外可以大量扩增培养，是未来临床使用的较理想的种子细胞;胶原-透明质酸钠复合膜有良好的组织/细胞相容性、适合的降解时间和孔隙结构，初步认为是一种可用于组织工程心脏瓣膜支架的生物材料。
参考文献
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基金项目:国家自然科学基金资助项目（编号:39970733）
作者单位:1710032陕西西安第四军医大学西京医院心血管外科
2 300162天津武警医学院平津医院心血管外科
3 300192天津中国医学科学院生物医学工程研究所
（收稿日期:2004-07-24）
（编辑云 兆）