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【摘要】 目的 探讨中国苗族人群血管紧张素原（AGT）基因M235T分子变异与心肌梗死（MI）的关系。方法 采用聚合酶链反应、限制性片段长度多态性（PCR/RFLP）分析，对73例MI患者和116例健康对照组进行AGT基因M235T等位基因检测。结果 MI患者AGT组235TT型（78.08%）高于对照组（43.96%），差异有非常显著性（P＜0.001）；T235等位基因（86.30%）的频率亦显著高于对照组（64.50%），差异有显著性（P＜0.05）。结论 AGT基因235TT型可能是中国苗族人群MI发病的重要危险因素之一。
【关键词】 心肌梗死；血管紧张素原；基因；聚合酶链反应
文献报道AGT基因存在多种变异，其中一种（M235T）位于外显子2核苷酸704处胸腺嘧啶（T）被胞嘧啶（C）所代替，导致编码产物第235号氨基酸（M）变异为苏氨酸（T），这种变异可导致冠心病和心肌梗死（MI）发病的危险性增加［1～2］。近几年来AGT基因与心血管疾病的关系日益引起重视。本研究旨在探讨AGT基因M235T分子变异与中国苗族人群MI发生的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 健康对照组 共116例，男67例，女49例，平均年龄（56.6±10.4）岁，且家族史中无MI或脑梗死。
1.1.2 心肌梗死（MI）组 共73例，男42例，女31例，平均年龄（59.6±10.4）岁。MI的诊断标准依据1979年WHO颁布的MI诊断标准。并做血清胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、载脂蛋白（A、B）、脂蛋白（a）、血糖（BS）。有心肌酶谱和心电图的典型改变，其中43例做ECT心肌灌注显像示心肌前壁及下壁心肌梗死。
以上两组均为苗族，家族婚姻史为世代族内通婚。来源于湖南西部吉首及重庆市秀山县、贵州毗邻地区的苗族群聚居区。对照组和心肌梗死（MI）组DNA样本分别来源于以上地区1999年3月～2003年9月门诊体检和住院病人。
1.2 方法
1.2.1 人基因组DNA的抽取 抽取外周静脉血5ml抗凝（EDTA-Na2），用6%Dextran(M6.0万）分离白细胞，蛋白酶K消化细胞核、氯仿抽提和乙醇沉淀、双蒸水重溶基因组DNA。具体步骤参考《分子克隆实验指南》。
1.2.2 AGT基因M235T分子变异检测 采用PCR/RFLP方法分析AGT基因的基因型，引物位于AGT基因第2外显子内，由Gibco-BRL公司合成，其序列为5’-CGTTTGTGCAGGGCGTGGCTCTC-3’和5’-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’（AC为非配对碱基）。在AGT基因外显子2核苷酸704处T转变C，并不改变限制性位点，但产生一个适合被Tth111I(CNNNGTC）酶切的“半位点”，与之相应的另一个“半位点”的引入是通过存在两个非配对碱基的PCR引物来完成，这两个非配对碱基并不干扰PCR的延伸。总反应体积为50μl。PCR程序：预变性94℃ 4min后，变性94℃ 30s，退火68℃ 60s，延伸72℃ 60s，最后72℃ 延伸8min，共30个循环，结束PCR。PCR产物经Tth111I（Promega公司）的限制性内切酶酶切（操作参照产品说明书）取酶解产物10μl用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳。EB染色后，UV透射仪上检测电泳条带并记录。
1.2.3 AGT基因M235T分子变异应用PCR/RFLP检测结果的判断标准 AGT基因M等位基因纯合型（235MM型）无酶切位点示一条163bp的扩增片段；AGT基因T等位基因纯合子（235TT型）被Tth111I酶切产生一条新的140bp的扩增片段；AGT基因M235T杂合子（235MT型）则同时具有163bp和140bp两种片段。
1.2.4 统计学方法 两组均数比较采用t检验；两组频数分布比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 MI组和对照组血脂、脂蛋白（a）和载脂蛋白有关的危险因素的比较 MI组脂蛋白（a）、ApoB显著高于对照组（P＜0.05），其余指标差异无显著性。见表1。
表1 MI组和对照组血脂、脂蛋白（a）和载脂蛋白有关的危险因素的比较（略）
注：*t=2096，P＜0.05；**t=3.07，P＜0.05
2.2 MI组和对照组 AGT基因型分布和等位基因的频率比较 在73例MI患者中235TT型57例，235MT型12例，235MM型4例。而对照组116例中235TT型51例，235MT型47例，235MM型18例。MI组235TT型频率（78.08%），非常显著高于对照组（43.96%）（P＜0.01）。MI组T235等位基因的频率（86.30%）显著高于对照组（64.50%）（P＜0.05）。见表2。
表2 MI组和对照组AGT基因型分布和等位基因的频率（略）
注：*χ2=24.655,P＜0.01；**χ2=16.6054，P＜0.01
3 讨论
对湖南西部及重庆、贵州毗邻地区73例MI患者和116例对照组进行AGT基因M235T多态性检测和分析，发现MI组235TT基因型非常显著高于对照组，T235等位基因的频率显著高于对照组。提示中国苗族人群AGT基因M235T多态性与MI发生密切相关。ApoB和Lp(a）与MI发生显著相关，但235TT基因型的MI患者与ApoB和Lp(a）中MI患者无显著相关。说明235TT基因型和ApoB和Lp(a）与MI发生是两个相互独立的危险因素。我们MI组AGT基因235TT型、235MT型、235MM型的频率分别为78.08%、16.44%和5.48%。与Katsuya等［1］报道新西兰冠心病21.9%、44.0%和34.0%有明显差异；与Kamitani等［2］报道日本MI患者235TT型为63.8%，其余两型和为36.2%有差异；与陈德等［3］报道上海地区MI患者235TT型70.18%有差异。这可能与不同种族和不同群体之间的差异有关。尽管不同学者报道的不同种群AGT基因的基因型分布有明显差异，但均提示AGT基因235型与MI的发生密切相关，其发生机制尚待进一步研究。
以前的研究发现AGT基因M235T分子变异与欧洲白种人［4］和日本人［5］的原发性高血压发生密切相关，但陈德等［3］报道MI组和对照组之间在统计学上差异无显著性，235TT基因型和T235等位基因的频率差异亦无显著性。因此上述结果提示的235TT基因型使MI危险性增加，不大可能是通过使高血压的危险性增加所致，而可能是由于MI患者AGT基因的遗传本身所致。
肾素-血管紧张素系统与心血管疾病的发生和发展密切相关，陆林等［6］报道了AGT基因插入/缺失多态性与中国人群MI明显相关。陈德等［3］报道AGT基因M235T分子变异可使中国人群MI发病危险性增加。本研究提示AGT基因M235T分子变异可使中国苗族人群MI发病危险性显著增加，而且独立于脂代谢之外，与脂代谢异常无明显的相关性。这为评价MI的危险性因素和识别MI的易患人群提供了另一个依据。
【参考文献】
1 Katsuya T, Koike G, Yee TW, et al. Association of angiotensinogen gene T235 variant with increased risk of coronary heart disease. Lancet,1995,345:1600-1603.
2 Kamitani A, Rakugi H, Higaki J, et al. Significance of the angiotensinogen gene polymorphism as a risk factor for myocardial infarction in the Japanese. Hypertension,1994,24:381(abstract）.
3 陈德，张眉，范维琥，等.血管紧张素原基因M235T分子变异与心肌梗死的关系.中华医学遗传学杂志,1998,15(3）:133-135.
4 Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev YV, et al. Molecular basis of hypertension: Role of angiotensinogen. Cell,1992,71:169-180.
5 Hata A, Namikawa C, Sasaki M, et al. Angiotensinogen as a risk factor for essential hypertension in Japan. J Clin Invest,1994,93:1285-1287.
6 陆林,于金德,祝少青,等.血管紧张素转化酶基因的插入和缺失多态性与心肌梗死关系的研究.中华心血管病杂志,1997,25(1）:30-33.
(编辑：商 洁）
作者单位： 416000 湖南湘西，湘西自治州人民医院检验科（△心内科，▲核医学科）