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【摘要】 目的 探讨雌激素对卵巢去势大鼠海马区tau蛋白Alzheimer样磷酸化的影响。方法 18只雌性成年SD大鼠随机分为卵巢去势组(OVX组)、卵巢去势+17-β雌二醇组(OVX+17-βE2组)和假手术组(Sham-OVX组)，OVX组和OVX+17-βE2组动物卵巢切除后10天起分别皮下注射生理盐水0.1ml/d、17-β雌二醇20μg/(kg·d)。Sham-OVX组动物只切开腹膜不切除卵巢，手术后10天起分别皮下注射生理盐水0.1ml/d 。各组动物连续用药5周后利用免疫印迹(Western Blot)和免疫组化方法检测tau蛋白在大鼠海马区tau-1(Ser199/Ser202)位点非磷酸化和PHF-1(Ser396/Ser404)位点磷酸化情况。结果 (1)免疫印迹结果显示，OVX组tau蛋白在海马区tau-1位点非磷酸化水平较OVX+17β-E2组和Sham-OVX组分别减少53%和57%(P<0.01, P<0.01)，OVX+17-βE2组和Sham-OVX组之间差异无显著性(P>0.05);OVX组tau蛋白在海马区PHF-1位点磷酸化水平较Sham-OVX组增加1.7倍(P<0.01), 而OVX+17-βE2组也较Sham-OVX组增加1.75倍(P<0.01)，OVX组和OVX+17-βE2组之间差异无显著性(P>0.05);(2)OVX组海马区tau-1的表达较Sham-OVX组和OVX+17-βE2组明显减弱，而OVX+17-βE2组与Sham-OVX组tau-1的表达强度差异无显著性;OVX组海马区PHF-1的表达较Sham-OVX组明显增强，而OVX+17-βE2组也较Sham-OVX组PHF-1的表达明显增强，OVX和OVX+17-βE2PHF-1的表达强度差异无显著性。结论 雌激素缺乏可以导致大鼠海马区tau蛋白的过度磷酸化，但补充雌激素并不能逆转tau蛋白的过度磷酸化。
【关键词】 雌激素;阿尔茨海默病;tau蛋白;卵巢去势大鼠;海马
Objective To explore the effect of 17-β estradiol on Alzheimer-like phosphoryltion of tau in hippocampus of ovariectimized rats.Methods 18 adult female rats were randomly divided into ovariectomy group (OVX group), 17-β estradiol group (OVX+17-βE2 group) and sham ovariectomy group (Sham-OVX group). The rats of OVX group and OVX+17-βE2 group were bilaterally ovariectomized and treated with normal saline (0.1ml/d) and 17-β estradiol (20μg/kg/d) for 5 weeks resptecively. The rats of Sham-OVX group were just injected with normal saline (0.1ml/d) for 5 weeks without ovariectomy. Western blotting and immunohistochemistry were performed for the phosphorylation of tau protein .Results (1) Western blotting results showed that as compared to OVX+17-βE2 group and Sham-OVX group, the non-phosphorylation of tau at tau-1(Ser199/Ser202) site in OVX group was decreased 53% and 57% resptecively (P<0.01, P<0.01). There was no difference between OVX+17-βE2 group and Sham-OVX group(P>0.05); The phosphorylation of tau at PHF-1 (Ser396/Ser404) site in OVX group and OVX+17-βE2 group were elevated significantly than that in Sham-OVX group (P<0.01, P<0.01). There was no difference between OVX group and OVX+17-βE2 group (P>0.05).(2) Immunohistochemical results showed that as compared to OVX+17-βE2 group and Sham-OVX group, the degree of tau-1 expression in Hippocampus in OVX group was decreased significantly. There was no difference between OVX+17-βE2 group and Sham-OVX group; The degree of PHF-1 expression in Hippocampus in OVX group and OVX+17-βE2 group were elevated significantly than that in sham-OVX group . There was no difference between OVX group and OVX+17-βE2 group . Conclusion The absence of estrogen may induce Alzheimer-like hyperphosphorylation of tau protein in ovariectimized rats brain hippocampus,while the complementarity of estrogen may not doubtless exert the protective effect of the Alzheimer-like phosphorylation of tau.
[Key words] estrogen;Alzheimer disease; tau proteins; ovariectimized rats; hippocampus
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是以神经系统功能和结构逐步丧失和萎缩为特征的神经退行性疾病，临床表现为进行性的认知功能障碍。大量研究结果显示，男女AD患病率存在明显的差异，女性的发病率为男性的2～3倍，且绝大多数女性患者于绝经后发病，提示雌激素缺乏与该病发生有关。但雌激素缺乏引起认知功能障碍和AD发生的机理还不十分清楚。以往研究发现[1]，雌激素缺乏可导致雌性大鼠海马区tau蛋白Alzheimer样过度磷酸化。为此，本研究拟通过建立卵巢去势大鼠模型，探讨雌激素对卵巢去势大鼠海马区tau蛋白Alzhemer样磷酸化的影响。
1 资料与方法
1.1 动物的分组和模型的建立
雌性成年SD大鼠18只，随机分为三组，每组6只。(1)去卵巢组(OVX组)：大鼠用10%水合氯醛(3～4ml/kg)腹腔注射麻醉，切除双侧卵巢，手术后10天起每只动物皮下注射生理盐水0.1ml/d;(2)17-β雌二醇组(OVX+17-βE2组)：双侧卵巢切除术后10天起，皮下注射17-β雌二醇20μg/(kg·d)(Sigma公司);(3)假手术对照组(Sham-OVX组)：动物只切开腹膜不切除卵巢，手术10天后每只动物皮下注射生理盐水0.1ml/d。三组动物连续给药5周后观察结果。
1.2 脑组织处理
每组取3只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后断头，剪开颅骨剥离脑膜取脑，置冰盘上，从大脑后部顶端拨开皮层，可见两侧海马，迅速分离海马，置于-70℃冻存备用。每组另外3只大鼠用10%水合氯醛麻醉后，经左心室行主动脉插管，快速灌入100ml生理盐水0.01%肝素，后滴注4%多聚甲醛400ml进行灌流固定，1h后取脑部组织(含海马)于含有相同固定液的小瓶中后固定10h，行振荡切片，厚度40μm。
1.3 免疫印迹(Western bloting) 分离的海马称重, 加入5倍体积匀浆液匀浆，其中含有pH 7.6 10mmol/L Tris盐酸，50mmol/L NaCl，50mmol/L NaF，1mmol/L Na3VO4，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1mmol/L苯甲脒，1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF )和蛋白酶抑制剂混合物(含胰蛋白酶醛肽，亮胰酶肽，胃蛋白酶抑制剂A的浓度均为2mg/L)(中山生物工程有限公司)。三倍体积匀浆组织加一倍体积的上样缓冲液[Tris.cl(pH 7.6)200mmol/L，8%SDS，40%甘油],在水浴中煮沸10min。溶解物12000r/min离心15min。取上清液加β巯基乙醇10mmol/L，用二喹啉甲酸(BCA)法(Rockford，IL，美国)测定蛋白含量。10%的分离胶分离上清液中的蛋白，转膜至硝酸纤维素膜(PVDF膜)，将PVDF膜用3%脱脂牛奶室温封闭1h，与第一抗体(检测tau蛋白Ser396/Ser404位点磷酸化水平的鼠抗PHF-1抗体1：250稀释;检测tau蛋白在Ser199/Ser202非磷酸化水平的鼠抗Tau-1抗体1:1000稀释，均由同济医学院病理生理教研室王建枝教授馈赠)，37℃孵育2h，碱性磷酸酶标记羊抗鼠二抗(West Grove , PA ,美国，1:1000稀释)37℃孵育1h，用5溴-4氯-3吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑(Rockford，IL，美国)法显色。蛋白条带由柯达数字科技1D软件进行定量分析(Eastman Kodak Company，NewHaven，CT，美国)，用总的光密度值表示蛋白条带的量[2，3]。
1.4 免疫组化
采用标准SP法检测Tau-1和PHF-1在大鼠海马组织中的表达。二抗试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按照操作方法说明进行。每张切片随机选取5个视野，NIKON显微镜数码显微摄像后，用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统(千屏影像公司)对免疫组化阳性染色的强度进行测定。
1.5 统计学处理
实验数据采用均数±标准误(x±s)表示, 采用SPSS统计软件ONEWAY ANOVA中LSD对各组进行两两比较，P<0.05为差异有显著性，具有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫印迹(Western bloting)结果
OVX组tau蛋白在海马区Tau-1位点非磷酸化水平较OVX+17-βE2组和Sham-OVX组分别减少53%和57%(P<0.01, P<0.01)，OVX+17-βE2组和Sham-OVX组之间差异无显著性(P>0.05);OVX组tau蛋白在海马区PHF-1位点磷酸化水平较Sham-OVX组增加1.7倍(P<0.01), 而OVX+17-βE2组也较Sham-OVX组增加1.75倍(P<0.01)，OVX组和OVX+17-βE2组之间差异无显著性(P>0.05);表明雌激素缺乏可以导致大鼠海马区tau蛋白在Ser199/202和Ser396/404位点产生过度磷酸化。但补充雌激素并不能逆转卵巢去势大鼠tau蛋白过度磷酸化，见图1。注：*OVX组与Sham-OVX组和OVX+17-βE2组比较， P<0.01;#OVX组与Sham-OVX组和OVX+17-βE2组比较， P<0.01图1 三组大鼠tau蛋白在海马区tau-1位点非磷酸化和PHF-1位点磷酸化水平
2.2 免疫组化结果
OVX组海马区Tau-1的表达较Sham-OVX组和OVX+17-βE2组明显减弱，而OVX+17-βE2组与Sham-OVX组tau-1的表达强度差异无显著性，见图2。OVX组海马区PHF-1的表达较Sham-OVX组明显增强，而OVX+17-βE2组也较Sham-OVX组PHF-1的表达明显增强，OVX和OVX+17-βE2PHF-1的表达强度差异无显著性，见图3。
3 讨论
Tau蛋白是神经细胞中含量最高的微管相关蛋白，其正常功能是促进微管蛋白组装成微管，并维持微管的稳定性。正常脑中tau蛋白的磷酸化程度是由蛋白激酶(催化磷酸化反应)和蛋白磷脂酶(催化去磷酸化反应)的活性来调节的。其中GSK-3β (glycogen synthase kinase-3β)在tau蛋白过度磷酸化中起最主要作用[4]。过度磷酸化tau蛋白在细胞内聚集形成神经元纤维缠结(neurofibillary tangle, NFT)，丧失其生理功能，导致认知功能障碍和AD发生[5]。近年的研究表明，雌激素缺乏在AD发病中起着重要的作用[6]，其机制可能通过多环节、多途径影响tau蛋白的表达及表达后的修饰，导致tau蛋白过度磷酸化，从而影响AD发生、发展[7，8]。本研究结果显示，卵巢去势大鼠海马区tau蛋白在Ser199/202和Ser396/404位点均发生过度磷酸化，表明雌激素缺乏可引起tau蛋白过度磷酸化。其具体机制目前尚不清楚。国内谭宁等[9]证实，去卵巢大鼠因雌激素缺乏引起神经细胞凋亡，caspase被激活。而活化的caspase可裂解tau蛋白，改变其空间构象，因而更易聚集成团，并暴露出其磷酸化位点，最后被GSK-3β磷酸化形成NFT[10]。因此，推测雌激素缺乏可能启动了神经细胞凋亡级联反应，caspase被激活，继而引起tau蛋白过度磷酸化。
目前，关于激素替代治疗是否能改善绝经后妇女认知功能，预防和治疗AD存在很大争议。2002年由美国国立卫生院(NIH)妇女健康启动项目(the women's health initiative,WHI)进行的一项随机、双盲、对照的多中心研究结果表明[11～13]，无论是雌孕激素连续联合治疗，还是单用雌激素治疗，均不能改善认知功能障碍，反可增加AD发病的危险性。其原因尚不清楚。Cardona-Gomez P等[14]对wister雌性成年大鼠行卵巢去势术后1个月后皮下注射17-β雌二醇(17-β E2)300μg/只，分别于用药后30min、1h、6h处死大鼠取海马，发现卵巢去势组GSK-3β活性和tau蛋白的磷酸化程度在17-βE2处理后1h较对照组增加2倍，6h后回复至对照组水平。笔者推测雌激素可能通过抑制GSK-3β活性，改善tau蛋白的异常过度磷酸化。但Papasozomenos SC等[15]通过卵巢去势大鼠模型发现补充苯甲酸雌二醇不能阻止热休克导致的大鼠海马区tau蛋白过度磷酸化，也不能抑制热休克导致的GSK-3β过度激活。本研究结果显示，补充雌激素后，卵巢去势大鼠海马区tau蛋白在Ser199/202位点的非磷酸化水平增加，但在Ser396/404位点的磷酸化水平也增加，提示补充雌激素并不能逆转卵巢去势大鼠tau蛋白过度磷酸化。由于Ser199/202和Ser396/404位点受多种蛋白激酶和蛋白磷脂酶的影响，在整体水平上补充雌激素必然会引起这个复杂的酶系统网络的级联反应。因此，补充雌激素是否能逆转tau蛋白过度磷酸化进而防止神经细胞退化还有待进一步研究。
(本文图2、图3见封三)
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