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【摘要】 目的利用ABO基因定型技术解决临床疑难血型定型1例。方法运用血型血清学方法、PCR-SSP(Sequence Specific Primer,SSP)基因定型法对比进行1例正反定型不符标本的检测。结果血清学方法不能正确定型。PCR-SSP法基因定型结果是该患者为O1O1V基因型。结论血型基因定型技术较血型血清学方法更准确、可靠，是血型血清学技术的极好补充。
【关键词】 PCR-SSP;血型血清学;正反定型不符;ABO基因定型;冷凝集素
近些年来，随着城市人口的激增，血站不仅在采供血量上增长很快，而且在实际工作中出现了更多的正反定型不符合标本，这些标本有来自血站内部检验科的，也有来自医院临床的。传统的血清学检测方法由于其自身局限性，因此面临很大挑战。笔者在实际工作中运用ABO基因定型方法解决了一些疑难血型定型的常见问题，现以1例临床配血中出现的正反定型不符标本的鉴定报告如下。
1材料与方法
1.1血型血清学试验
按照文献[1]操作。抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白试剂、标准试剂ABO红细胞、谱细胞均由上海血液生物医药有限责任公司制备。
1.2血型基因定型PCR-SSP; 血型血清学; 正反定型不符; ABO基因定型;冷凝集素采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术。DNA提取严格按照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行。引物为采用瑞典隆德Martin.L.Olsson研究小组[2~4]与笔者自行设计，内对照为扩增人类生长激素基因(HGH),均由上海生工合成。PCR扩增仪为美国ABI公司9700。引物混合物检测的基因特异性、突变位点和PCR产物片段大小见表1。引物序列见表2。
1.2.1PCR反应体系总反应体系10μl,引物浓度10pmol/μl,dNTPs浓度10pmol/μl,基因组DNA浓度50ng/μl,15mM MgCl2 (SIGMA公司),内对照引物浓度5pmol/μl,5U/μl Taq DNA聚合酶(Promega,Shanghai)，甘油和甲酚红终浓度分别为5%和0.01% (SIGMA公司)。表1基因分型引物检测的基因特异性、突变位点和PCR产物片段大小
1.2.2PCR循环参数采用热启动DNA变性技术96℃预置7min,然后按94℃ 30s,66℃ 30s,72℃ 1min 进行32个循环，再72℃延伸2min。
1.2.3电泳PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴别，电压153V,时间15min，DNA Marker DL2000为TRAASTM公司产品，凝胶成像仪拍照观察结果(见图1)。
2结果
患者,女,25岁，2011年2月患贫血入住省二院。医院在配血中发现其血型正反定型不符,遂请求本中心配型科鉴定。血清学鉴定结果及基因定型结果分别见表3和图1。表3患者血清学结果图1表3显示：该患者正定型为AB型，反定型为O型。存在正反定型不符合现象。 图1显示：只有1、4泳道扩增出了特异性条带，1、4泳道分别为O1和O1V基因的扩增产物，因此该患者基因型为O1O1V。
3讨论
患者血型血清学结果正反定型不符，正定型为AB型，反定型为O型。因反定型O细胞、自身细胞凝集，提示该献血员血清中存在冷凝集素。37℃水浴后，正定型抗A、抗B、抗A1、抗AB和反定型O细胞、自身细胞凝集消失，证明该患者血清中存在冷凝集素抗体。至此，定型不符的原因找到。基因定型图谱显示出了其O1O1V基因型：1、4泳道为O1和O1V基因，2、3泳道为A基因，3、5、6泳道为B基因。患者样本只在1、4泳道扩增出了特异性条带。
综上所述，此类标本在血站或医院血库的日常工作中会经常遇到，具有较典型的代表性。此套常规ABO基因定型方法，切合实际，在3h内可完成从DNA抽提到基因扩增的完成，效率较高，相对血型血清学方法，能在较短时间内准确解决疑难血型标本的定型问题。此PCR-SSP法较PCR-RFLP法[3](限制性内切酶法)具有省时、简便的特点。虽然血清学凝集反应是鉴定血型的基本方法，但是有其局限性，而以DNA为检材的基因分型技术，不受血型抗体来源以及生物活性细胞的限制。采用高通量基因分型平台可以检测血型基因变异体。当今，经典免疫血液学和分子免疫血液学很自然地整合在一起，形成了“后基因组时代免疫血液学”。在整合的前提下，血清学方法和基因分型方法取长补短，相互补充，不存在谁取代谁的问题。从提高输血安全性方面考虑，向临床提供基因分型的血液制品，从供受者表型匹配逐步升级到基因型匹配，是今后的发展方向。血清学技术相对比较普及，当前加强分子生物学教育显得刻不容缓[5]。基因定型技术作为血型血清学方法的极好补充，应当为广大血型工作者所熟知和掌握。
【参考文献】
1肖星甫 输血技术手册成都：四川科学技术出版社，1992：494-514
2Olsson ML,Chester MA.Frequent occurrence of a variant O1 allele at the blood group ABO locus.Vox Sang，1996,70:26-30
3刘长利，龚晓燕，王卓妍，等北京地区汉族人群ABO血型基因分型研究中国实验血液学杂志,2008，16(2):425-428
4Okeefe DS,Dobrovic A.A rapid and reliable PCR method of genotyping the ABO blood group Ⅱ: A2 and O2 alleles .Human mutation,1996,8:358
5赵桐茂后基因组时代的免疫血液学中国输血杂志，2010，23(10):848-849