毕赤酵母羧肽酶对重组双功能水蛭素C端的降解作用

　　【摘要】 目的  探讨重组双功能水蛭素是对野生型水蛭素分子进行结构改造后形成的新型分子。 方法  将Arg-Gly-Asp（RGD）三肽序列引入分子的合理部位，使这种水蛭素衍生物在保留抗凝活性的同时，又增加了抗血小板聚集的活性。我们已用实验证明这种双功能水蛭素比野生型分子有更强的防栓作用，用于血管吻合术后的抗凝、防栓治疗安全有效，剂量低于野生型水蛭素。 结果  本实验室研制的注射用重组双功能水蛭素经HPLC纯度分析，发现其主峰后有一小峰。通常毕赤酵母在发酵过程中，分泌羧肽酶，可水解蛋白质C末端氨基酸，使表达产物不均一。我们用分子筛层析和离子交换层析无法将两个峰分开，进一步通过LC/MS分析，主峰成分的分子量为7030Dalton，后面小峰成分的分子量为7180Dalton，两者之差为150Dalton左右。符合我们设计的原性分子的C末端谷氨酸的分子量。同时，我们通过HPLC分离得到两峰组分，分别测定了两峰组分的抗凝血酶比活性和抗血小板聚集比活性，两者几乎没有差别，都符合质量标准。 结论  由此证明重组双功能水蛭素cDNA基因表达产物在发酵过程中C末端谷氨酸被毕赤酵母羧肽酶水解、脱落，但C末端谷氨酸对双功能水蛭素的活性几乎没有影响;同时也证明两峰组分均可为表达产物，小峰并非杂质。
    
　　【关键词】  重组双功能水蛭素;羧肽酶;降解作用
         
　　The C terminal of recombinant RGD-hirudin was hydrolyzed by yeast car-boxypeptidase
     
　　ZHANGYan-ling，MO Wei，YANG Xin-ying，et al.

　　The Key Laboratory of Molecular Medicine，Ministry of Edu-cation，Fudan University，Shanghai200032，China
   
　　【Abstract】 Objective Based on the research of structure and function of wt-hirudin，RGD-hirudin was de-signed and made by recombinant DNA technique.Methods The clone encoding r-RGD-hirudin was constracted and highly expressed by Pichia pastoris.R-RGD-hirudin is a specific thrombin inhibitor and platelet aggregation inhibitor.Pharmacodynamics showed that the dosage of r-RGD-hirudin for prevention of thrombosis was decreased2-3times of wt-Hirudin.HPLC showed r-RGD-Hirudin included two parts，and they could not be separated by gel filtration or ion exchange chromatography.Analysis of LC/MS was used.Results The molecular weight of one part was7030D，the other is7180D.So the part with molecular weight7030D shouldbe r-RGD-hirudin which was hydrolyzed by yeast carboxypeptidase.The last aminoacid of C terminal is glutamic acid and its molecular weight is150D.Conclusion We separated two parts by HPLC，and we also determined the anti-thrombin and anti-platelet aggregation specific activity of every part.Their anti-thrombin specific activities were12030ATU/mg and11960ATU/mg.The inhibitive ratios of platelet aggregation with final concentration2.5μg/ml were21.79%and20.51%.The result proved both of parts were r-RGD-hirudin.
   
　　【Key words】 r-RGD-hirudin;carboxypeptidase;hydrolysis
      
　　天然水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂 ［1，2］ ，从医用水蛭的唾液腺中提取而得。它是一条含65或66个氨基酸残基的无糖基化的单链多肽，分子量约7kD，其N端为活性区，含3对二硫键，对其空间构象起稳定作用;其C端含有较多的酸性氨基酸，能与凝血酶碱性氨基酸富集的区域特异性结合，从而进一步增强其抗凝作用。水蛭素对凝血酶有很高的亲和力 ［3］ ，它与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价结合的可逆复合物，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制纤维蛋白的凝固，同时它也能阻断凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应。所以低浓度的水蛭素即可有效地抑制血液凝固。基于水蛭素的这些特点与生物学活性，用它作为防治血栓的药物有诸多优点:（1）专一性强，特异性直接抑制凝血酶活性，不良反应少而轻;（2）分子量小，几乎没有抗原性;（3）几乎没有毒性。是一种抗凝防栓药物。

    由于从医用水蛭中提取天然水蛭素产量低，价格昂贵，工艺复杂。本实验室曾经用基因工程的方法，成功地在大肠杆菌及哺乳动物细胞中表达了重组水蛭素，但表达效率较低。非常规酵母表达系统如毕赤酵母（Pichiapastoris）近年来被广泛采用，具有分泌型高效表达，使产物分离纯化简便等优点 ［3］ 。我们在保留水蛭素原有的生物学作用的基础上，将Arg-Gly-Asp（RGD）编码顺序融合在水蛭素cDNA的合理部位 ［4，5］ 。构建了含RGD编码顺序的双功能水蛭素cDNA克隆RGD-Hirudin-pPIC9K，表达质粒转化毕赤酵母后，经筛选获得高表达菌株，并建立工程菌株（另文发表）。发酵罐大量培养工程菌，经甲醇诱导后，从培养液上清纯化重组双功能水蛭素，并证明这是一种水蛭素的衍生物，兼有抗凝血酶和抗血小板集聚的双重功能 ［6］ 。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 主要设备、化学试剂和实验动物

    1.1.1 发酵罐 为5L BioFlo3000美国NBS公司产品;FPLC系统为美国AKTAExplore（Pharmarcia）;层析柱:Sephadex-G50（Pharmarcia）凝胶过滤柱（7.5cm×100cm），Q-Sepharose-F.F.（Pharmarcia）离子交换柱（2.6cm×15cm）;多功能双通道血小板聚集仪为上海斯隆医电设备有限公司产品。

    1.1.2 HPLC主机 SHIMADZU SPD-10AUV-VIS detector/LC-10AD liquid chromatograph;LC/MS主机:HPLC:Wa-ters2690&Waters2487/MS:Waters ZQ2000;色谱柱:Waters Delta PAK C18-300A3.9mm×15cm、Waters Symmetry300C18。

　　1.1.3 试剂 凝血酶购自中国药品-生物制品检定所;其他试剂为进口或国产分析纯。

　　1.2 菌种和培养基

    1.2.1 菌种 RGD-Hirudin-pPIC9K/GS115由本室构建。

　　1.2.2 摇瓶种子培养基 BMGY［1%Yeast extract、2%Pep-tone、100mmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0）、1.34%YNB、（4×10 -5 ）%biotin、1%Glycerol］。

    1.2.3 发酵基础培养基（低盐发酵培养基） H 3 PO 4 （85%stock）13ml/L、CaSO 4 ·2H 2 O0.93g/L、K 2 SO 4 18.2g/L、MgSO 4 7.27g/L、KOH10.6g/L、Sodium citrate·2H 2 O1.47g/L、Glycerol4%（W/V）、PTM 1 （2ml/L终浓度，高压灭菌后加入）。

    1.2.4 微量元素（PTM 1 ） CuSO 4 ·5H 2 O6g/L、MnSO 4 ·H 2 O3g/L、H 3 BO 4 0.2g/L、ZnCl 2 20g/L、KI0.8g/L、Na 2 MoO 4 ·2H 2 O0.2g/L、CoCl 2 0.5g/L、FeSO 4 ·7H 2 O65g/L、H 2 SO 4 5ml/L、CaSO 4 ·2H 2 O0.5g/L、biotin0.2g/L（0.22μm滤膜过滤除菌）。

    1.2.5 发酵补料 甲醇补料:PTM 1 （2ml/L终浓度）加入100%甲醇中;甘油补料:PTM 1 （2ml/L终浓度）加入50%甘油溶液中。

　　1.3 方法

    1.3.1 发酵培养液上清样品HPLC分析 甲醇诱导后，取不同时间点的培养液上清样品，用HPLC分析。

    流动相:流动相A:水+0.1%TFA，流动相B:100%乙腈+0.1%TFA;梯度:50min内流动相B从0%～50%;流速:0.5ml/min;检测波长:280nm;样品处理:用0.22μm过滤器，将培养液上清过滤，OASIS小柱脱盐，稀释样品，终浓度为 1.0mg/ml;进样量:20μl。

    1.3.2 样品各组分分离及分子量测定 流动相:流动相A:0.1%甲酸，流动相B:100%乙腈;梯度:0min90%A+10%B，20min50%A+50%B，25min90%A+10%B;流速:0.2ml/min;检测波长:280nm;质量扫描范围:1200～1800;样品浓度:100μg/ml;进样量:50μl。

    1.3.3 样品各组分分离及抗凝比活性和抗血小板聚集比活性测定 流动相:流动相A:水+0.1%TFA，流动相B:100%乙腈+0.1%TFA;梯度:100min内流动相B从0%～100%;流速:0.5ml/min;检测波长:280nm;样品处理:将1mg/ml（1ml）的样品原液冷冻干燥，用0.2ml水复溶;样品浓度:5mg/ml;样品上样量:20μl。
    1.3.4 抗凝血酶比活性测定采用凝血酶滴定法 抗血小板聚集比活性测定采用比浊法 ［7］ 。

　　2 结果
    
　　2.1 经HPLC分析 甲醇诱导后，重组双功能水蛭素的表达水平逐步提高。随着时间的延长，最后一个氨基酸脱落的重组双功能水蛭素含量也随之提高，诱导结束后，培养液上清中的主要成分为含65个氨基酸残基的重组双功能水蛭素，约占总量的70%左右（如图1）。

    2.2 抗凝血酶比活性和抗血小板聚集比活性测定 经HPLC分离2个组分，分别测定两者的抗凝血酶比活性和抗血小板聚集比活性，结果显示，以凝血酶滴定法测定抗凝血酶比活性:样品（批号:20020601，HPLC主峰成分）12030ATU/mg;样品（批号:20020601，HPLC小峰成分）11960ATU/mg，见表1，两者抗凝血酶比活性差异没有显著性。以比浊法抗血小板聚集比活性:样品（批号:20020601，HPLC主峰成分）终浓度2.5μg/ml的血小板聚集抑制率为21.79%;样品（批号:20020601，HPLC小峰成分）终浓度2.5μg/ml的血小板聚集抑制率为20.51%，见表2，两者的抗血小板聚集比活性差异没有显著性。
    
　　表1 Specific activity of anti-thrombin　略     
    
　　表2 Specific activity of anti-platelet aggregation　略
     
　　2.3 用MS测定2组的分子量 经HPLC分离2个组分，用MS测定2组分的分子量，样品（批号:20020601，HPLC主峰成分）分子量为7030D;样品（批号:20020601，HPLC小峰成分）分子量为7180D（见图2、3），两者分子量之差为150D，符合谷氨酸的分子量。（本文图片略）
    
　　3 讨论
     　　
　　Timothy J.等人通过X射线晶体衍射试验发现野生型水蛭素的活性中心在分子的N端，Pro46-Lys47-Pro48是非常特异的结构，能够介导水蛭素与凝血酶特异性结合 ［5，8］ 。水蛭素的C端柔性很大，并且含有较多的酸性氨基酸（最后9个氨基酸残基中有6个酸性氨基酸），能与凝血酶碱性氨基酸残基富集的部位特异性结合，有利于发挥抗凝活性。凝血酶有4个结合位点:纤维蛋白结合位点（即底物识别位点）、非活性底物识别位点、酶活性中心和肝素结合位点。水蛭素与非活性底物识别位点和酶活性中心两个位点结合。与凝血酶以摩尔比1:1方式形成非共价结合的可逆复合物（结合常数为230fmol/L），然后发挥抗凝作用。水蛭素与凝血酶特异性结合是一个二相的过程，首先，在Pro46-Lys47-Pro48结构的介导下，C端封闭凝血酶的非活性底物识别位点，并使凝血酶的构型发生轻微的改变，促进水蛭素的N端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性。

    本实验室研制的重组双功能水蛭素在野生型分子中引入了RGD三肽序列，分子构型有轻微改变。为保证其与凝血酶分子特异结合，我们根据计算机分子对接模拟的结果（insight II软件，如图4），对重组双功能水蛭素C端作了适当的改变，使其N端与凝血酶活性中心更易结合，有利于发挥抑制凝血酶活性。同时，我们用毕赤酵母表达目的蛋白，酵母在发酵过程中可能分泌羧肽酶，使表达产物C端氨基酸降解、脱落，有文献报道，天然或重组野生型水蛭素分子是含65～66个氨基酸残基的单链多肽。为此，我们特意在C端加入一个谷氨酸。谷氨酸对羧肽酶特别敏感，极易降解、脱落，这样羧肽酶主要作用于谷氨酸，而对其他C端的氨基酸残基几乎没有作用，即我们在分子设计时特意

    加入的C端谷氨酸对重组双功能水蛭素的C端结构有保 护和稳定作用 ［9］ 。

    从培液中纯化的纯重组双功能水蛭素（样品批号:20020601）经HPLC、LC/MS鉴定，终产物有2个部分组成，主要成分的分子量为7030D，次要成分的分子量为7180D，两者之差为150D左右，符合谷氨酸的分子量。同时，我们通过HPLC分离得到两个组分，分别测定了两个组分的抗凝比活性和抗血小板聚集比活性，两者几乎没有差别。所有结果表明毕赤酵母羧肽酶对重组双功能水蛭素C端的降解作用。

    由于重组双功能水蛭素的活性中心不在C端，因此，这种降解作用并不影响其生物学功能，两种组分都是具有抗凝血酶活性和抗血小板聚集活性双重功能的抗凝、防栓剂。因此，我们实验室研制的注射用重组双功能水蛭素最终产品含2个组分，主要成分为分子量7030D，含量为70%左右;第二成分为分子量7180D，涵量为30%左右。

　　【参考文献】
    
　　1 Timothy J.The structure of a complex of recombinant hirudin and hu-man-thrombin.Science，1990，249:277-280.

    2 Chari S.Hirudin-based synthetic peptides as inhibitors of thrombin. Semin Thromb Hemost，1994，20:315-318.

    3 LIU Feng.Expression system of nonconventional yeasts for genetic engi-neering.Chinese Journal of Biotechnology，1996，12（1）:1-5.

    4 Modi NB，Baughman SA，PaaschBD，et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of TP-9201，a GP IIb/IIIa antagonist in rats and dogs.J Cardiovasc Pharmacol，1995，25:888-897.

    5 Chang JY.The functional domain of hirudin，a thrombin-specific in-hibitor.FEBS Lett，1983，164:307-313.

    6 Mo Wei，Zhang Yanling，Song Houyan，et al.Fermentation，purifica-tion and identification of recombinant RGD-hirudin.Chinese Journal of Biotechnology，2004，20（1）:126-129.

    7 Markwardt F，Sturzebecker J，Griessbach U.Hirudin as an inhibitor of thrombin.Method in Enzymology，1970，19:924-932.

    8 Timothy J.The structure of a complex of recombinant hirudin and hu-man-thrombin.Science，1990，249:277-280.

    9 Lyle TA.Small-molecule inhibitors of thrombin.Perspect Drug Discov Design，1993，14:453-460.  

　　基金项目:上海市现代生物与新药发展基金（编号:04DZ19205）

　　作者单位:200032上海，复旦大学教育部分子医学重点实验室
   
　　（编辑:李 弋）