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【摘要】 本实验选用昆明种小鼠为研究系统，用尾静脉注射(iv.)给药途径观察了一次给予替曲朵辛后小鼠的急性毒性反应，并测定了LD5、LD50、LD95和LD99值。结果表明，小鼠在注射替曲朵辛后主要中毒症状为平卧、抽搐、死亡。死亡时间多发生在注射后10～20s。用Bliss法计算出LD5、LD50、LD95和LD99值分别为：6.35、8.48、11.32和12.76μg/kg。存活动物继续观察7天未见异常。
【关键词】 替曲朵辛；急性毒性；小鼠；安全评价
观察小鼠一次静注替曲朵辛后所产生的毒性反应和死亡情况并计算LD5、LD50、LD95和LD99的值。
1 材料与方法
1.1 供试品
1.1.1 名称、缩写 替曲朵辛(Tetrodotoxin,TTX)。
1.1.2 物理性质 分子式C11H17N3O8，MW 319.28，微溶于水，不溶于有机溶剂。
1.1.3 规格剂型及批号 规格剂型：针剂，15μg/ml,2ml/安瓿。批号：990122-3。
1.1.4 供试品稳定性和保管 温度：在4℃～5℃冰箱内冷藏保存。湿度：室内湿度范围。光线：可不避光保存。保存条件：因其毒性大，加锁保管。
操作要求：操作时须穿工作服，戴一次性乳胶手套，所用器皿在使用后须用碱液处理，剩余药液交回。
登记程序：每次取用时按要求登记，剩余交回。
1.1.5 溶剂 0.02%稀醋酸水溶液。临用前用注射用水稀释。
1.2 研究系统
1.2.1 种属 昆明种小鼠。
1.2.2 性别和数量 100只，雌雄各半。
1.2.3 动物年龄 约40日龄。
1.2.4 动物体重 18～22g,给药前禁食8～12h。
1.2.5 动物来源 军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：医动字第01-3023号(小鼠，一级)1999。
1.2.6 研究系统选择说明 依据审批要求，啮齿类动物可以采用小鼠作为实验系统。
1.2.7 研究系统标记程序 动物到达后，按SOPAO34的要求接收。小鼠每笼10只，笼卡上标明课题号、供试品号、动物号、组别、性别及剂量水平。
1.2.8 饲养条件 室温(25±5)℃，温度(60±20)%，自动通风，室内氨含量小于20ppm，光照14h。
1.2.9 检疫过程 按SOPA055要求检疫观察一周，剔除不合格动物。
1.2.10 饲料 本院实验动物中心提供的固体膨化饲料，自由摄食。
1.2.11 水 自由饮用自来水，每日换一次。
1.3 实验设计
1.3.1 实验设计的依据
1.3.1.1 委托单位提供的急毒资料
小鼠：MLD(最小致死剂量)8.0μg/kg(ip.),8.22μg/kg(iv.)，LD508～10μg/kg(ip.)，9～11μg/kg(iv.),435μg/kg(po.)。
大鼠：LD508μg/kg(iv.)。
人： LD100 7μg/kg。
1.3.1.2 委托单位提供的药效学资料 大鼠：5和10μg/kg均能不同程度地抑制吗啡戒断症状。
1.3.1.3 委托单位提供的临床试用方案［1］ 剂量：未定，疗程：＜7天，途径：肌肉注射。
1.3.1.4 新药研究标准 我国卫生部颁发的《新药审批办法》和《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》中有关规定。
1.3.1.5 预试验结果 见表1。
表1 替曲朵辛预试验结果（略）
1.3.2 实验分组及剂量设计 采用本中心编制的应用软件LabWorkers中的随机分组程序对小鼠进行分组，每组动物数为10只，雌雄各半。各组剂量均按等比级数设计，小鼠设10个剂量组，iv.剂量分别为22.00、18.70、15.90、13.51、11.48、9.76、8.30、7.05、5.99和5.09μg/kg(剂量等比级数为0.85)。
1.3.3 供试品给予途径及给药容量 小鼠尾静脉iv.，0.1ml/10g体重。
1.3.4 给予供试品的途径说明 委托单位指导的给药途径。
1.3.5 试验观察 一次给药，连续观察7天，记录动物毒性反应情况及死亡动物数，死亡动物及时尸检。
1.3.6 死亡动物分布及LD50测定 选用1993年7月卫生部药政司颁布的《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》中推荐的Bliss法［2］，在微机上运行《药理学计算与程序》之P33计算LD5、LD50、LD95和LD99的值及其95%可信限。
2 结果
2.1 中毒症状 小鼠iv.后约10s，动物表现为不同程度的平卧、抽搐，片刻后(一般在10～20s)死亡。存活下来的动物连续观察7天，未见其他异常及死亡。死亡动物大体解剖未见异常。
2.2 死亡动物分布及LD50测定 死亡动物分布情况见表2。
表2 小鼠一次iv.替曲朵辛后动物死亡分布情况（略）
注：“-”表示没有进行计算
截取13.51～5.99六组，用Bliss法，在微机上运行《药理学计算与程序》之P33计算LD5、LD50、LD95和LD99的值及其95%可信限。结果如下：
机率单位(Y)=-7.179708+13.11818×LOG(D)
相关系数(R)=0.9780029
回归系数(B)=13.11818,B的标准误=1.564904
LD5=6.354323μg/kg；95%可信限：5.490051～7.354654
LD50=8.481258μg/kg；95%可信限：7.841861～9.172792
LD95=11.32012μg/kg；95%可信限：9.813521～13.05802
LD99=12.75767μg/kg；95%可信限：10.58284～15.37945
3 讨论
本实验观察了小鼠一次iv.给予替曲朵辛后动物的急性毒性反应，并测定了LD5等值。结果表明，小鼠在注射替曲朵辛后主要中毒症状为平卧、抽搐、死亡。用Bliss法计算出小鼠(iv.)LD5、LD50、LD95和LD99的值分别为6.35、8.48、11.32和12.76μg/kg。95%可信限分别为5.490051～7.354654、7.841861～9.172792、9.813521～13.05802和10.58284～15.37945。
【参考文献】
1 郑筱萸.化学药品/生物制品研究指导原则(试行).2001.
2 中华人民共和国卫生部药政局，新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)，1993，202-203.
(编辑：悦 铭)
作者单位： 100050 北京，中国医学科学院中国协和医科大学新药安全评价研究中心
100850 北京，军事医学科学院毒物药物研究所